Os métodos tradicionais de avaliação adipogenic diferenciação são baratos e fáceis de usar, mas não são específicos para alterações na expressão gênica. Nós desenvolvemos um ensaio para quantificar a diferenciação de células mesenquimais em adipócitos maduros, usando um marcador específico de linhagem. Este ensaio tem diversas aplicações através de pesquisa básica e clínica médica.
Vários corantes estão disponíveis atualmente para uso na detecção de diferenciação das células mesenquimais em adipócitos. Corantes, tais como O de óleo vermelho, são mais barato, fácil de usar e amplamente utilizada pelos laboratórios, analisando o potencial de adipogenic das células mesenquimais. No entanto, eles não são específicos para alterações na transcrição do gene. Nós desenvolvemos um ensaio de diferenciação de gene-específico para analisar quando uma célula mesenquimal mudou seu destino para uma linhagem de adipogenic. Imuno-rotulagem contra ácidos graxos ligação proteína-4 (FABP4), um marcador de linhagem específica de adipogenic diferenciação, permitiu a visualização e quantificação de células diferenciadas. A capacidade de quantificar adipogenic potencial de diferenciação das células mesenquimais em um formato de 96 microplacas bem tem implicações promissoras para um número de aplicações. Centenas de ensaios clínicos envolvem o uso de células estromais mesenquimais adultas e é actualmente difícil correlacionar os resultados terapêuticos dentro e especialmente entre tais ensaios clínicos. Este ensaio de FABP4 simples do elevado-throughput fornece um ensaio quantitativo para avaliar o potencial de diferenciação das células do paciente-derivado e é uma ferramenta robusta para comparar diferentes métodos de isolamento e expansão. Isto é particularmente importante dado o reconhecimento crescente da heterogeneidade das células sendo administrado a pacientes em produtos de células mesenquimais. O ensaio também tem potencial utilidade na triagem de drogas de alto throughput, particularmente na obesidade e pré-diabetes pesquisa.
Um dos principais requisitos estabelecidos pela sociedade internacional para terapia celular (ISCT) para definir uma célula estroma mesenquimal multipotent é que as células têm a capacidade de se diferenciarem no adipogenic, osteogênico e linhagens de chondrogenic 1. os métodos convencionais de diferenciação nestes três linhagens de medição dependem a detecção de produtos macromoleculares usando corantes químicos1. Corantes, tais como O óleo de vermelho (que manchas de gotículas de gordura nas células que sofreram adipogenesis), são baratos e fáceis de usar; no entanto eles não conseguem detectar alterações específicas na expressão gênica que ocorrem quando as células mesenquimais diferenciarem em cada respectiva linhagem2. Aqui, nós desenvolvemos um ensaio de diferenciação que quantifica a expressão da proteína para um marcador de linhagem específica de adipogenic, ácido graxo ligação proteína-4 (FABP4)3,4,5. FABP4 foi inicialmente encontrado em de adipócitos 3T3-L1 murino3 e mais tarde foi descoberto para ser expressos no tecido adiposo subcutâneo humano6. É uma proteína citosólica, que atua como um acompanhante para orientar a captação de ácidos graxos pelas células e está envolvido no processo de Lipólise4.
As células precursoras utilizadas para os ensaios de diferenciação foram adiposa células estromais mesenquimais derivadas (ASCs)7,8. ASCs compartilham muitas propriedades com medula óssea derivados mesenquimais células-tronco (BM-MSCs), uma população de grandes células-tronco mesenquimais em adultos8,9. ASCs oferecem várias vantagens sobre BM-MSCs em uma aplicação clínica, como maior rendimento de células pode ser isolado de tecido mais prontamente acessíveis fontes8,9. Uma população de células isoladas precisa atender a determinados critérios sejam definidos como ASCs. Primeiro, eles devem mostrar adesão aos vasos de plástico de cultura de tecidos em condições de cultura padrão1. Eles também devem mostrar de expressão do antígeno de superfície específica1. Incultos ASCs caracterizam-se pela expressão do antígeno de superfície positiva de CD34, CD73, CD90, baixa expressão de CD105 e expressão negativa de CD45 e HLA-DR10. ASCs purificados pelo cultivo em plástico para 28 dias (aderente purificado ASCs) mostram expressão positiva de CD73, CD90 e CD105 e expressão negativa de CD34, CD45 e HLA-DR10. Finalmente, as células devem manter a capacidade de se diferenciar em várias linhagens1,7,8.
Protocolos de diferenciação Adipogenic induzem upregulation marcante de expressão FABP4 entre outros genes de linhagem dos adipócitos, então usamos imunoquímica Visualizar FABP4 proteína dentro das células e em seguida quantificado FABP4 expressão no nível da célula única usando um microscópio de triagem automatizada de alto teor fluorescente. Este método é vantajoso sobre corantes tradicionais, como permite a confirmação altamente específica de diferenciação dos adipócitos-linhagem. Tais ensaios de linhagem específica do gene combinados com alto teor de métodos de triagem também permitem a quantificação da proporção de células dentro de uma preparação de células heterogêneas que são capazes de diferenciação para baixo uma linhagem particular. Em nossos estudos usamos o ensaio FABP4 para confirmar a perda do potencial de diferenciação de adipogenic de ASCs recentemente isolados após a cultura de células.
Este artigo demonstra a utilidade e vantagens de FABP4 encontrava para detectar com precisão e quantificar adipócitos maduros derivados de células estromais mesenquimais. FABP4 é capaz de detectar mudanças na expressão de uma linhagem específica de proteína3,4,5 em adipócitos maduros, ao contrário de outros comumente utilizados corantes qual rótulo macromolecular muda13,14 como óleo vermelho O15, Nilo vermelho16 e Sudan Black17. FABP4 encontrava permite a visualização e análise das alterações na morfologia celular. Esta é uma vantagem distinta sobre métodos anteriormente descritos usando quantitativa transcrição reversa PCR (RT-qPCR) que analisa as alterações a nível de transcrição, sem qualquer visualização5,18,19 ,20, ou citometria de fluxo que requer células em suspensão20, ou que mancha ocidental requer células para ser lysed para isolar proteínas19,20. FABP4 encontrava é estável em células fixas, não vazar na solução e sendo uma proteína citosólica quando rotulados em um monolayer aderente das células, se sobrepõem com o núcleo, permitindo a fácil visualização e adicionado a precisão na análise automatizada.
Triagem de alto teor é vantajosa porque é rápido, exato, reprodutível e objetiva. Fornece uma plataforma para custo efetivo uso de reagentes e tempo de pesquisador, desde análise e aquisição de imagem exigem a mínima manipulação manual e dependem do processamento automático do instrumento. Vários fatores foram identificados como críticos para a precisão e reprodutibilidade o inquérito de alto teor de ensaios de31. A quantificação da expressão do antígeno baseia-se na qualidade da imagem. Para a análise de imagem bem sucedida, imagens de cada canal por bem devem estar em foco e cair dentro de um alcance dinâmico ideal para valores de cinza (Auto expor configurações são ideais). Fora de foco ou de imagens saturadas conduzir a resultados erróneos.
Algumas possíveis limitações dos métodos descritos neste artigo incluem o seguinte. O requisito de software especializado de equipamentos e análise de imagens. Enquanto fora do escopo deste artigo, opções de software de fonte aberta alternativa (por exemplo, ImageJ32,33, Fiji34, CellProfiler32,35) podem ser usadas para executar a segmentação de imagens semelhantes tarefas; no entanto eles exigem as habilidades para baixar e adaptar as macros disponíveis on-line ou gravar macros/comandos para as tubulações de análise específicos. Inerente a tudo automatizado pipelines de análise de imagens é um nível de ruído de fundo. Em grande parte, isto pode ser atribuído aos restos, erro de qualidade ou análise imagem pobre, enfatizando a necessidade de preparação da amostra de cuidado e cuidado set-up da plataforma de imagem e análise. O rótulo de FABP4 em ratos foi encontrado para detectar progenitoras indiferenciadas30; enquanto os controles neste estudo (que consistem em células indiferenciadas) são desprovidas de coloração específica de FABP4. Este golo sob a necessidade de verificar a expressão FABP4 indiferenciados progenitores em cada contexto biológico onde o ensaio é empregado.
A fim de estabelecer comparações válidas entre o FABP4 rotulagem e óleo vermelho O mancha, as medições de saída da análise de imagem precisava ser biologicamente relevantes. Consequentemente, a medição, ‘% de células positivas’ foi usada para FABP4 e ‘área de coloração por célula’ foi utilizada para óleo vermelho O. Vale ressaltar que a medida ‘% de células positivas’ não foi usada para o óleo vermelho O rotulados células em nosso estudo, porque não foi possível atribuir as gotículas de gordura rotuladas com precisão para um determinado núcleo; as gotículas de gordura variaram consideravelmente no tamanho, número e distribuição em todo o corpo da célula e raramente sobrepunham com o núcleo. Óleo vermelho O manchando a variabilidade existente entre as células derivadas de tecidos diferentes fontes; enquanto o % positivo medida de células não era apropriada para o atual estudo, outro grupo usou com sucesso para quantificar adipócitos derivados de células-tronco humanas glândula22 onde a mancha de óleo vermelho O apareceu como uma grande gota de gordura que medidos a citoplasma e sobreposta com núcleos e permitindo dados para ser apresentado como % de células positivas.
Em contraste, a morfologia da FABP4 encontrava é consistente em adipócitos derivados de uma variedade de tecidos diferentes fontes23,24,25. A capacidade de quantificar a proporção de células dentro de uma cultura capaz de diferenciação tem um número de aplicações. Células estromais mesenquimais adultas segura promessa significativa para uma variada gama de usos terapêuticos. Uma questão importante que surgiu com tradução clínica é a variabilidade inerente a capacidade dessas células entre pacientes26, entre os locais de isolamento27,28e entre os métodos para isolamento12 e expansão da célula números12 para uso terapêutico. Ficou demonstrado anteriormente que as culturas de células do estroma aderentes são frequentemente heterogêneas, com algumas células capazes de diferenciação e alguns não 12,17 como nosso FABP4 ensaio demonstra para culturas ASC. Ensaios como este, combinados com técnicas de enriquecimento, ajudará a identificar subpopulações dentro de culturas heterogêneas capazes de diferenciação da linhagem específica. Ter um ensaio padronizado e quantificável como este ensaio FABP4 fornece um método simples para comparação entre todas essas variáveis e o potencial para avaliar os resultados terapêuticos dentro e entre os ensaios clínicos.
A quantificação de FABP4 em um modo semi automatizado permite que a objetividade e reprodutibilidade em análise em muitos casos de doador e amostras. Além disso como o rótulo é citoplasmático, que pode potencialmente ser usado para analisar a hipertrofia (aumento do tamanho dos adipócitos) Além de hiperplasia (aumento no número de adipócitos), uma distinção que é de grande importância na pesquisa da obesidade, onde hipertrofia é fortemente associada com disfunção adiposa em indivíduos obesos,21. A epidemia de obesidade tem estimulado uma quantidade significativa de interesse na identificação de drogas capazes de controlar o armazenamento de lipídios. Este ensaio FABP4 também fornece uma leitura simples para a seleção de milhares de compostos por sua capacidade de inibir o acúmulo de lipídios.
The authors have nothing to disclose.
Somos gratos aos doadores de tecidos adiposo e os profissionais de pesquisa que coletam e nos fornecem este recurso para pesquisa de uso. Nós gostaríamos de reconhecer o apoio pela Allergan financeiro. Agradecemos também à Universidade de Auckland, da faculdade de medicina e saúde ciências desempenho baseado fundo de investigação para financiamento do custo de videoing e edição para apresentação deste artigo.
Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |