传统的评价脂肪分化的方法既便宜又容易使用, 但并不特定于基因表达的变化。我们已经开发出一种用谱系特异标记将间充质细胞分化为成熟脂肪的实验。这种检测方法在基础研究和临床医学中有不同的应用。
几种染料目前可用于检测骨髓间充质细胞分化为脂肪脂。染料, 如油红色 O, 是廉价的, 易于使用和广泛利用的实验室分析的脂肪潜力的间充质细胞。然而, 它们并不特定于基因转录的变化。我们已经开发了一种基因特异的分化分析, 以研究何时间充质细胞将其命运转变为脂肪血统。免疫标签对脂肪酸结合 protein-4 (FABP4), 一个血统特定的标记脂肪分化, 使可视化和量化的分化细胞。用96井微板块格式量化脂肪分化潜能的能力, 对许多应用有很好的影响。数以百计的临床试验涉及使用成人间充质基质细胞, 目前很难将治疗结果与此类临床试验之间的关系, 特别是在这方面。这种简单的高通量 FABP4 检测为评估患者源性细胞的分化潜能提供了定量的检测方法, 是比较不同分离和扩张方式的有力工具。这一点尤其重要, 因为越来越多的人认识到在间充质细胞产品中对患者进行的细胞异质性。该方法在高通量药物筛选方面也有潜在效用, 特别是在肥胖和糖尿病前期研究中。
国际细胞治疗学会 (ISCT) 确定多能间充质基质细胞的关键要求之一是细胞必须具有分化成脂肪、成骨和软骨血统的能力。1. 传统的方法测量分化成这三血统依赖于检测大分子产品使用化学染料1。染料, 如油红色 O (在细胞中染色脂肪滴在已经历成脂), 是廉价和易于使用;然而, 当间充质细胞分化为各自的谱系2时, 它们无法检测出基因表达的具体变化。在这里, 我们已经开发了一种分化检测, 量化的蛋白质表达脂肪谱系特定标记, 脂肪酸结合 protein-4 (FABP4)3,4,5。FABP4 最初在小鼠 3T3-L1 脂肪细胞3中发现, 后来被发现在人皮下脂肪组织6中表达。它是一种胞浆蛋白, 它作为一个伴侣来指导细胞的脂肪酸摄取, 并参与了脂肪4的过程。
用于分化检测的前体细胞为脂肪源性间质基质细胞 (陶瓷)7,8。陶瓷与骨髓间充质干细胞 (BM-MSCs) 有许多性质, 这是成人的主要骨髓间充质干细胞,8,9。在临床应用中, 陶瓷提供了一些优于 BM MSCs 的优势, 因为更大的细胞产量可以从更容易接近的组织来源中分离出来8,9。一个孤立的细胞群需要满足一定的标准来定义为陶瓷。首先, 它们必须在标准培养条件下表现出对塑料组织培养容器的粘附1。它们还必须显示特定的表面抗原表达式1。落后陶瓷的特征是 CD34 的阳性表面抗原表达, CD73, CD90, CD105 的表达低和 CD45 和 HLA-DR10的阴性表达。陶瓷在塑料上培养28天 (黏附纯化陶瓷) 显示 CD73、CD90 和 CD105 的阳性表达, CD34、CD45 和 HLA-DR10的阴性表达。最后, 单元格必须保留区分为各种沿袭的能力1,7,8。
脂肪分化协议诱导上调的 FABP4 表达在其他脂肪细胞谱系基因, 所以我们使用免疫化学可视化 FABP4 蛋白在单元格中, 然后量化 FABP4 表达在单细胞水平使用全自动荧光高含量筛查显微镜。这种方法优于传统染料, 因为它能够高度明确地确认脂肪细胞谱系分化。这种基因特异谱系检测结合高含量筛选方法也可以量化的细胞比例在异构细胞的准备, 能够分化下来的特定血统。在我们的研究中, 我们使用 FABP4 检测来确认细胞培养后新鲜分离陶瓷脂肪分化潜能的丧失。
本文阐述了 FABP4 immunolabelling 对间充质基质细胞的成熟脂肪干细胞进行准确检测和定量量化的效用和优越性。FABP4 能够检测到一个沿袭特定蛋白3,4,5在成熟脂肪细胞中表达的变化, 与其他常用染料的标签大分子变化13,14如油红色 O15、尼罗河红色16和苏丹黑色17。FABP4 immunolabelling 允许可视化和分析细胞形态学的变化。这是一个独特的优势比以前描述的方法使用定量反向转录 PCR (RT-qPCR), 分析变化的成绩单水平没有任何可视化5,18,19 、20或流式细胞术, 要求单元格处于悬浮20中, 或需要细胞裂解以隔离蛋白质1920的西方印迹。FABP4 immunolabelling 是稳定的固定细胞, 不泄漏出在溶液中, 是一个胞浆蛋白当标签在一个黏附分子层的细胞, 将重叠与核允许容易的可视化和增加准确性的自动化分析。
高含量的筛选是有利的, 因为它是快速, 准确, 重现性和客观。它提供了一个成本有效使用试剂和研究员时间的平台, 因为图像采集和分析需要最少的手工操作, 并且依赖于仪器的自动处理。有几个因素被认为对高含量筛选化验的准确性和重现性至关重要31。抗原表达的量化依赖于图像质量。为了获得成功的图像分析, 每个频道的图像必须集中在一个灰度值的最佳动态范围内 (自动曝光设置是理想的)。不集中或饱和的图像导致错误的结果。
本文所述方法的一些潜在限制包括以下内容。对专门的成像设备和分析软件的要求。在本文的范围之外, 可使用替代的开源软件选项 (例如, ImageJ32、33、斐济34、CellProfiler32、35) 来执行类似的图像分割。任务;但是, 他们需要的技能, 以下载和定制的宏可用在线或编写宏/命令, 他们的特定分析管道。所有自动成像分析管道的固有特性是一个背景噪声级别。这主要归因于碎片、图像质量差或分析错误, 强调需要仔细取样准备和仔细设置成像和分析平台。发现小鼠的 FABP4 标签检测未分化的祖细胞30;虽然本研究中的控制 (包括未分化细胞) 缺乏特定的 FABP4 染色。这不足以检查在每一个生物背景下, 在使用该检测的每个生物学环境中检验未分化祖 FABP4 表达的必要性。
为了在 FABP4 标签和油红色 O 染色之间进行有效的比较, 从图像分析中得出的输出测量需要与生物学相关。因此, 测量, “% 阳性细胞” 被用于 FABP4, 和 ‘ 染色面积每细胞 ‘ 被用于油红色 O。值得注意的是, 该措施 ‘% 阳性细胞 ‘ 没有用于油红色 O 标记细胞在我们的研究, 因为它是不可能准确地将标签的脂肪滴归因于一个给定的核;脂肪滴在细胞体的大小、数量和分布上相差很大, 很少与细胞核重叠。不同组织来源的细胞之间存在油红色 O 染色变异;虽然 the% 阳性细胞测量不适合目前的研究, 另一组已成功地使用它来量化从人类腺体干细胞衍生的脂肪细胞22 , 其中油红色 O 染色出现的一个大脂肪滴, 横跨细胞质和细胞核重叠, 使数据 as% 阳性细胞呈现。
相比之下, FABP4 immunolabelling 的形态学是一致的脂肪细胞来自不同的组织来源的范围23,24,25。在能够分化的文化中, 量化细胞比例的能力有许多应用。成人间充质基质细胞对多种治疗用途具有重要的前景。临床翻译中出现的一个重要问题是, 在26之间、隔离站点27、28和隔离方法之间, 这些细胞之间的能力固有变化12和扩展单元格编号12用于治疗使用。以前已经表明, 黏附的基质细胞的文化经常是异质的, 有些细胞可以分化, 一些不是12,17 , 因为我们的 FABP4 化验显示了 ASC 文化。像这样的化验, 结合浓缩技术, 将有助于确定异种文化中的亚群体, 能够对谱系特异分化。有一个标准化的, 可量化的化验, 如这种 FABP4 化验提供了一个简单的方法来比较所有这些变量, 并有可能评估治疗结果内和之间的临床试验。
FABP4 的量化在半自动化的方式, 使客观和重现性的分析, 在许多捐助者的案例和样本。此外, 由于标签是细胞质, 它可能被用来分析肥大 (脂肪细胞大小的扩大) 除了增生 (脂肪细胞数量增加), 这是相当重要的区别, 在肥胖研究, 其中肥厚与肥胖个体的脂肪功能障碍密切相关21。肥胖症的流行已经激发了对能够控制脂质贮存的药物的大量兴趣。这种 FABP4 的检测还提供了一个简单的读数, 以筛选数以千计的化合物, 以抑制脂质积累的能力。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢脂肪组织的捐赠者和研究人员, 他们收集并提供这一资源给我们进行研究使用。我们想确认 Allergan 的资金支持。我们还感谢奥克兰大学, 医学和健康科学学院以绩效为基础的研究基金, 用于资助录像和编辑的费用, 以便提交本条。
Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |