Traditionele methoden voor de beoordeling van de differentiatie van de adipogenic zijn goedkoop en makkelijk te gebruiken, maar zijn niet specifiek voor wijzigingen in genexpressie. Hebben we een test om te kwantificeren mesenchymale celdifferentiatie in volwassen adipocytes met behulp van een specifieke marker van afkomst. Deze bepaling heeft diverse toepassingen in basisonderzoek en klinische geneeskunde.
Verschillende kleurstoffen zijn momenteel beschikbaar voor gebruik bij de opsporing van differentiatie van mesenchymale cellen in adipocytes. Kleurstoffen, zoals olie Red O, zijn goedkoop, makkelijk te gebruiken en wijd gebruikt door laboratoria analyseren het adipogenic potentieel van mesenchymale cellen. Nochtans, zijn zij niet specifiek zijn voor veranderingen in gen transcriptie. We hebben een gen-specifieke differentiatie test om te analyseren wanneer een mesenchymale cel zijn lot is overgeschakeld naar een adipogenic afstamming ontwikkeld. Immuno-etikettering tegen vetzuur bindende eiwit-4 (FABP4), een geslacht-specifieke marker van adipogenic differentiatie, visualisatie en kwantificering van gedifferentieerde cellen ingeschakeld. De mogelijkheid om te kwantificeren adipogenic differentiatie mogelijkheden van mesenchymale cellen in de indeling van een 96 goed microplate heeft veelbelovende gevolgen voor een aantal toepassingen. Honderden van klinische proeven wordt gekenmerkt door het gebruik van volwassen mesenchymale stromale cellen en het is momenteel moeilijk te correleren therapeutische resultaten binnen en vooral tussen dergelijke klinische proeven. Deze eenvoudige high-throughput FABP4 assay biedt een kwantitatieve test voor het beoordelen van het potentieel van de differentiatie van patiënt-afgeleide cellen en is een krachtige tool voor het vergelijken van verschillende methoden voor isolatie en expansie. Dit is vooral belangrijk gezien de toenemende erkenning van de heterogeniteit van de cellen wordt toegediend aan patiënten in mesenchymale cel producten. De bepaling heeft ook potentiële nut in hoge-doorvoer drug screening, met name in zwaarlijvigheid en pre diabetes onderzoek.
Een van de belangrijkste voorschriften van de internationale vereniging voor cellulaire therapie (ISCT) om een multipotente mesenchymale stromale cel te definiëren is dat de cellen de mogelijkheid hebben moeten om te differentiëren in de adipogenic, osteogenic en de chondrogenic-geslachten 1. conventionele methoden voor het meten van differentiatie in deze drie geslachten is afhankelijk van de opsporing van macromoleculaire producten met behulp van chemische kleurstoffen1. Kleurstoffen zoals olie Red O (die vlekken dikke druppels in cellen die adipogenesis hebben ondergaan), zijn goedkoop en makkelijk te gebruiken; echter verzuimen om de opsporing van de specifieke wijzigingen in genexpressie die optreden wanneer mesenchymale cellen onderscheiden in elke respectieve lineage2. Hier hebben we een differentiatie test die eiwit expressie voor een adipogenic afstamming-specifieke marker, vetzuur bindende eiwit-4 (FABP4)3,4,5 kwantificeert. FABP4 werd in eerste instantie gevonden in lymfkliertest 3T3-L1 adipocytes3 en werd later ontdekt moet worden uitgedrukt in menselijke onderhuids vetweefsel6. Het is een cytosolische eiwit, die fungeert als een chaperone bij vetzuur opname door cellen en is betrokken bij het proces van lipolyse4.
De van voorlopercellen die worden gebruikt voor het testen van de differentiatie waren obesitas afgeleide mesenchymale stromale cellen (ASC’s)7,8. ASC’s delen vele eigenschappen met beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen (BM-MSCs), een grote mesenchymale stamcellen bevolking in volwassenen8,9. ASC’s bieden verschillende voordelen ten opzichte van BM-MSCs in een klinische toepassing, zoals meer rendement van cellen geïsoleerd van beter toegankelijk weefsel bronnen8,9 worden kan. Een geïsoleerde celpopulatie moet voldoen aan bepaalde criteria worden gedefinieerd als ASC’s. Eerst, moeten ze laten zien van naleving van kunststof weefsel kweekvat in standaard cultuur voorwaarden1. Ze tonen ook moeten specifieke oppervlakte-antigeen expressie1. Onbeschaafd ASC’s worden gekenmerkt door positieve surface antigeen uitdrukking van CD34, CD73, CD90, lage uitdrukking van CD105 en negatieve uitdrukking van CD45 en HLA-DR10. ASC’s gezuiverd door het kweken op kunststof voor 28 dagen (aanhanger gezuiverd ASC’s) tonen positieve uitdrukking van CD73, CD90 en CD105 en negatieve expressie van CD34, CD45 en HLA-DR10. Tot slot moeten cellen behouden de mogelijkheid om te differentiëren in verschillende geslachten1,–7,8.
Adipogenic differentiatie protocollen induceren opvallende opregulatie van FABP4 expressie onder andere adipocyte lineage genen, zodat we Immunochemie gewend met het visualiseren van FABP4 eiwitten in cellen, en vervolgens gekwantificeerd FABP4 expressie op het niveau van één cel met behulp van een geautomatiseerde fluorescerende high-content screening Microscoop. Deze methode is voordelig over traditionele kleurstoffen zoals hierdoor zeer specifieke bevestiging van adipocyte-bloedlijn differentiatie. Deze gen specifieke lineage gehaltebepalingen gecombineerd met een hoog gehalte screeningmethoden ook inschakelen kwantificering van het aantal cellen binnen de voorbereiding van een heterogene cel die in staat van differentiatie naar beneden een bepaalde afkomst zijn. In onze studies gebruikten we de bepaling van de FABP4 te bevestigen verlies van adipogenic differentiatie mogelijkheden van vers geïsoleerde ASC’s na celkweek.
Deze paper toont het nut en de voordelen van FABP4 immunolabelling voor het nauwkeurig detecteren en kwantificeren van de volwassen adipocytes afgeleid van mesenchymale stromale cellen. FABP4 is het kundig voor speurder veranderingen in de expressie een geslacht specifieke proteïne3,,4,5 in volwassen adipocytes, in tegenstelling tot andere vaak gebruikte kleurstoffen welk label macromoleculaire13,14 verandert zoals olie Red O15, Nijl rood16 en Sudan Black17. FABP4 immunolabelling zorgt voor visualisatie en analyse van de veranderingen in de cellulaire morfologie. Dit is een onderscheidend voordeel ten opzichte van eerder beschreven methoden gebruiken van kwantitatieve omgekeerde transcriptie PCR (RT-qPCR) die wijzigingen op het transcript-niveau zonder enige visualisatie5,18,19 analyseert ,20, of stroom cytometry waarvoor cellen in schorsing20, of westelijke bevlekken dat vereist cellen worden lysed eiwit19,20te isoleren. FABP4 immunolabelling is stabiel in vaste cellen, niet in oplossing doet uitlekken en wordt een cytosolische eiwit wanneer geëtiketteerd in een aanhangend enkelgelaagde van cellen, zal overlappen met de kern waardoor voor eenvoudige visualisatie en nauwkeurigheid toegevoegd in de geautomatiseerde analyse.
Hoge-content screening is voordelig, want het is snel, accuraat, reproduceerbare en objectieve. Het biedt een platform voor kosteneffectieve gebruik van reagentia en onderzoeker tijd, aangezien Beeldacquisitie en analyse minimale handmatige manipulatie vereist en op de automatische verwerking van het instrument vertrouwen. Verschillende factoren werden geïdentificeerd als kritiek aan de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de screening van hoge-inhoud testen31. De kwantificering van antigeen expressie is afhankelijk van de beeldkwaliteit. Voor succesvolle beeldanalyse, beelden van elk kanaal per putje moeten worden in focus en een optimale dynamisch bereik vallen voor grijswaarden (Auto bloot instellingen zijn ideaal). Out of focus of verzadigde beelden leiden tot onjuiste resultaten.
Enkele mogelijke beperkingen van de in dit artikel beschreven methoden omvatten de volgende. De eis voor gespecialiseerde apparatuur en analyse imagingsoftware. Terwijl het buiten het bestek van dit artikel, kunnen alternatieve opensource softwareopties (bijvoorbeeld ImageJ32,33, Fiji34, CellProfiler32,35) worden gebruikt voor het uitvoeren van gelijkaardige beeldsegmentatie taken; echter hebben zij de vaardigheden om te downloaden en online op maat van macro’s beschikbaar of het schrijven van macro’s / opdrachten voor hun specifieke analyse pijpleidingen nodig. Die inherent zijn aan alle geautomatiseerde imaging analyse pijpleidingen is een niveau van achtergrondgeluiden. Dit kan grotendeels worden toegeschreven aan puin, slechte beeld kwaliteit of analyse fout, benadrukken de noodzaak voorzichtig monstervoorbereiding en zorgvuldige set-up van de beeldvorming en analyse platform. Het label van de FABP4 in muizen is gebleken om te detecteren ongedifferentieerde progenitoren30; terwijl de controles in deze studie (die bestaan voor ongedifferentieerde cellen) verstoken van specifieke FABP4 kleuring zijn. Deze geringe scoort de noodzaak van het controleren van FABP4 expressie gedifferentieerdeproductie progenitoren in elke biologische context waar de assay werkzaam is.
Om geldige vergelijkingen tussen de FABP4 etikettering en olie Red O kleuring, de metingen van de uitvoer van beeldanalyse moest biologisch relevant zijn. Dus de meting, ‘% positieve cellen’ werd gebruikt voor FABP4, en “ruimte van kleuring per cel” werd gebruikt voor olie rood O. Het is opmerkelijk dat de maatregel ‘% positieve cellen’ niet werd gebruikt voor olie Red O geëtiketteerd cellen in onze studie, want het was niet mogelijk om de gelabelde dikke druppels nauwkeurig toeschrijven aan een bepaalde kern; de dikke druppels gevarieerd aanzienlijk in grootte, aantal en de verdeling over de cel lichaam en zelden overlappen met de kern. Olie Red O kleuring variabiliteit bestaat tussen cellen afgeleid uit verschillende weefsel bronnen; terwijl de % positieve cellen maatregel was niet geschikt is voor de huidige studie, een andere groep heeft het met succes gebruikt te kwantificeren adipocytes afgeleid van menselijke klier stamcellen22 waar de olie Red O kleuring verscheen als één grote dikke druppel die overspannen de cytoplasma en overlappende met kernen en waardoor de gegevens worden gepresenteerd als % positieve cellen.
Daarentegen is de morfologie van FABP4 immunolabelling consequent adipocytes afgeleid van allerlei verschillende weefsel bronnen23,24,25. De mogelijkheid om te kwantificeren van het aantal cellen binnen een cultuur staat differentiatie heeft een aantal toepassingen. Volwassen mesenchymale stromale cellen houdt belangrijke belofte voor een breed scala aan therapeutische toepassingen. Een belangrijke kwestie die is ontstaan met klinische vertaling is de inherente variabiliteit in het vermogen van deze cellen tussen patiënten26, tussen sites van isolatie27,28, en tussen de methoden voor de isolatie12 en uitbreiding van cel nummers12 voor therapeutisch gebruik. Het heeft aangetoond eerder dat culturen van aanhangend stromale cellen zijn vaak heterogene, met sommige cellen staat van differentiatie en sommige niet 12,17 als onze FABP4 toont assay voor ASC culturen. Testen zoals dit, in combinatie met de technieken van de verrijking, zal helpen bij het identificeren van de subpopulatie binnen heterogene culturen staat van geslacht-specifieke differentiatie. Met een gestandaardiseerde, kwantificeerbare assay zoals deze FABP4 assay biedt een eenvoudige methode voor vergelijking tussen al deze variabelen, en het potentieel om te evalueren van therapeutische resultaten binnen en tussen de klinische proeven.
De kwantificering van FABP4 in een semi-automatische mode objectiviteit en reproduceerbaarheid in analyse mogelijk maakt, in heel veel gevallen van de donor en monsters. Bovendien als het label cytoplasmatische is, het kan potentieel worden gebruikt om te analyseren hypertrofie (uitbreiding van adipocyte grootte) naast hyperplasie (toename in adipocyte nummer), een onderscheid dat is van groot belang in obesitas onderzoek, waar hypertrofie is sterk geassocieerd met obesitas dysfunctie in zwaarlijvige individuen21. De obesitas-epidemie heeft aangespoord een significante hoeveelheid van belang bij het identificeren van de drugs kunnen regelen van lipide-opslag. Deze FABP4 assay voorziet ook in een eenvoudige uitlezing screenen duizenden compounds voor hun vermogen om te remmen lipide accumulatie.
The authors have nothing to disclose.
Wij zijn dankbaar aan de donoren van het vetweefsel en de onderzoek-professionals die verzamelen en deze bron aan ons verstrekt voor gebruik in onderzoek. Wij willen erkennen financiering ondersteuning door Allergan. Wij zijn ook dankbaar aan de Universiteit van Auckland, Faculteit van de medische en Health Sciences prestaties gebaseerd onderzoek Fund voor de financiering van de kosten van videoing en bewerken voor de indiening van dit artikel.
Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |