脂肪細胞分化を評価する従来の方法では遺伝子発現の変化に固有ではありませんが、安くて使いやすい。間葉系細胞の分化成熟脂肪細胞の血統の特定のマーカーを使用して定量化するアッセイを開発しました。このアッセイでは、基礎医学と臨床医学の間で多様なアプリケーションがあります。
いくつかの染料は、間葉系細胞の脂肪細胞への分化を検出するに使用するため現在利用します。オイル赤 O などの染料は間葉系細胞の脂肪分化能の分析研究所、安い、使いやすい、広く利用。しかし、彼らは遺伝子のトランスクリプションの変更に固有ではありません。間葉系細胞が脂肪細胞系列にその運命を切り替えを分析する遺伝子特異的分化アッセイを開発しました。脂肪酸結合タンパク質 4 (FABP4)、脂肪細胞分化の系統特異マーカーに対して免疫ラベルには可視化と分化細胞の定量化が有効になります。96 よくマイクロ プレート フォーマットでの間葉系細胞の脂肪細胞分化を定量化することは、アプリケーションの数の有望な意味を持ちます。何百もの臨床試験を含む成人間葉系間質細胞の使用と現在内と特にそのような臨床試験の治療結果を関連付けることは困難です。この単純な高スループット FABP4 アッセイ患者由来細胞の微分の潜在性を評価するための定量的アッセイを提供、さまざまな分離と拡張方法を比較するための強力なツールです。間葉系細胞製品で患者に投与されている細胞の多様性の増加の認識を与え、これは特に重要です。アッセイ肥満と糖尿の研究で特に、高スループット薬物スクリーニングの潜在的効用があります。
多能性間葉系間質細胞を定義するために、細胞療法 (ISCT) の国際協会によって確立された重要な要件の 1 つは細胞、脂肪細胞、骨と軟骨細胞系統に分化する能力が必要です。1。 これら 3 つに分化を測定の従来の方法は化学染料1を使用して高分子製品の検出に依存します。(これは脂肪細胞形成を経た細胞における脂肪滴を汚れ) オイル赤い O などの染料が安くて使いやすい。しかし彼らは、各それぞれのリネージュ2に間葉系細胞が分化するときに発生する遺伝子の特定の変化を検出する失敗します。ここでは、脂肪細胞の系統特異マーカー、脂肪酸結合タンパク質 4 (FABP4)3,4、5の発現を定量化する分化アッセイを開発しました。FABP4 は、マウス 3T3 ‐ L1 脂肪細胞3で発見された当初とひと皮下脂肪組織6で表される発見された後。ゾル性細胞質蛋白質、細胞による脂肪酸取り込みをガイドするシャペロンとして機能し脂肪分解4過程で関与しているです。
前駆細胞の分化アッセイに使用された脂肪派生間葉系間質細胞 (Asc)7,8。Asc は、骨髄由来間葉系幹細胞 (BM MSCs)、大人8,9の主要な間葉系幹細胞の人口の多くのプロパティを共有します。Asc は、細胞の大きな収率はより容易にアクセス可能な組織ソース8,9から分離でき、臨床応用に BM MSCs 上いくつかの利点を提供しています。孤立セル人口は、Asc として定義される特定の条件を満たす必要があります。まず、標準的な文化の条件1でプラスチックの組織培養容器への付着を見せなければなりません。また、表面抗原式1を表示する必要があります。難の Asc は CD45 と HLA の10の否定的表現、低発現 CD105 CD90 CD73 CD34 の肯定的な表面抗原の発現によって特徴付けられます。プラスチック (付着精製 Asc) 28 日間培養精製 Asc は CD105、CD90 CD73 の肯定的な表現と CD34、CD45、HLA-DR の10の否定的表現を示しています。最後に、細胞は様々 な系統1,7、8に分化する能力を保持する必要があります。
脂肪細胞分化プロトコル FABP4 の細胞内でタンパク質の視覚化に検体を使用し、単一セルのレベルで FABP4 式を定量化、FABP4 式他の脂肪細胞系列遺伝子の中の印象的なアップレギュレーションを誘発します。自動蛍光高コンテンツ スクリーニング顕微鏡を使用します。この方法は伝統的な染料上有利な脂肪細胞系列の分化過程の非常に特定可能です。スクリーニング法も高いコンテンツと組み合わせるような遺伝子特定の血統のアッセイは、特定系統に分化可能な異種セル準備内のセルの割合の定量化を有効にします。私たちの研究では細胞培養後新鮮単離 Asc の脂肪細胞の微分の潜在性の損失を確認する FABP4 アッセイを使用されます。
本稿は、ユーティリティと正確に検出し、成熟脂肪細胞に由来する間葉系間質細胞を定量化する FABP4 immunolabelling の利点を示します。FABP4 は血統で、特定の蛋白質3,4,5その他一般的に反して成熟した脂肪細胞に発現の変化使用高分子どちらのラベル変更13,14 染料を検出することがオイル赤い O15、Nile Red16スーダン ブラック17など。FABP4 immunolabelling 可視化や細胞の形態変化の解析ができます。これは定量的逆転写 PCR (RT qPCR) 任意視覚化5,18,19 せずトラン スクリプト レベルでの変更を分析するを使用して上記の方法で特徴的な利点 ,20、またはフローサイトメトリー懸濁液20、または西部にしみが付くことにする細胞が必要なタンパク質19,20を分離する分離するセルが必要です。FABP4 immunolabelling 固定セルが安定している、ソリューションに漏れないが、ゾル性細胞質蛋白質の細胞付着性単分子膜のラベルとされて、容易な視覚化を可能にする、自動化された分析の精度を追加核と重複。
高コンテンツ スクリーニングは、高速、正確、再現性のある客観的だから便利です。画像集録および解析を最小限の手動操作を必要とする、計測器の自動処理に依存は試薬と研究時間の費用効果が大きい使用のためにプラットフォームを提供します。いくつかの要因が決定的な要素として識別された、再現性高いコンテンツ スクリーニングの試金31。抗原の発現の定量化は、画像の品質に依存します。成功画像解析、ウェルあたり各チャネルからの画像する必要がある焦点になるし、グレー値の最適なダイナミック レンジ内に収まる (自動公開の設定が理想的)。フォーカスまたは誤った結果へ飽和画像鉛のアウト。
この資料で説明する方法のいくつかの潜在的な制限は次のとおりです。専門的なイメージング機器と解析ソフトウェアの要件。類似画像の領域分割を実行する、この資料の範囲外にいて代替オープン ソース ソフトウェア オプション (たとえば、ImageJ32,33, フィジー34, CellProfiler32,35) を使用できます。タスク;ただし、ダウンロードしオンライン使用可能なマクロを調整またはその特定の解析パイプラインのマクロ/コマンドを記述するスキルが不要します。バック グラウンド ノイズのレベルはすべての自動イメージング解析パイプラインに固有のものです。これは主の破片に起因することができます悪いイメージ品質または解析エラー、注意して試料調製及び画像処理および解析プラットフォームの注意セットアップ必要性を強調します。30未分化前駆細胞を検出するマウス FABP4 ラベルが見つかりました(これは未分化細胞から成っている) 本研究でコントロールしながら特定 FABP4 の染色を欠いています。このアンダー スコアは、FABP4 式をチェックインの必要性未分化前駆細胞アッセイの採用、各生物学的文脈で。
ため、FABP4 ラベリング及びオイル赤 O 染色、生物学的に関連する必要な画像解析からの出力測定値間の有効な比較を描画します。したがって、FABP4、使用された測定、’% 陽性細胞’ と ‘セルあたり染色の領域’ だったオイル赤い o. に使用オイル赤 O 標識脂肪滴を与えられた核; 正確に原因はなかったので我々 の研究で細胞を標識にメジャー ‘% 陽性細胞’ が使用されて注目すべきです。脂肪滴は細胞体のサイズ、数、流通にかなり変化し、核とほとんど重なります。オイル赤 O 染色可変性が異なる組織源由来の細胞間に存在します。% 陽性細胞測定が現在の研究のため適当ではない、別のグループが正常に使用して脂肪細胞に由来する人間の腺細胞22を定量化するため、スパン 1 つの大きな脂肪滴として登場オイル赤 O 染色、細胞質と核と % 陽性細胞として提示される有効にするデータ。
対照的に、FABP4 の immunolabelling の形態は脂肪細胞に由来する様々 な組織のソース23,24,25の範囲で一貫しました。細胞分化のことができる文化の中での比率を数値化することで、アプリケーションの数。大人の間葉系間質細胞は、多様な治療上の使用の重要な約束を保持します。臨床の翻訳で生じている重要な問題は患者26間、分離27,28, サイト間分離12 法およびこれらの細胞の能力に固有の変動とセル番号12治療上の使用の拡大。付着性間質細胞の培養は頻繁に異種、ASC 文化のアッセイを示していくつかの細胞分化およびいくつかは12,17私たち FABP4 としてことができる、それは以前示されています。このような試金、濃縮技術と組み合わせて、異種文化系統固有の分化の能力内のサブ集団を特定しやすくなります。この FABP4 アッセイなど、定量化が可能な標準化されたアッセイを持つすべてのこれらの変数と臨床試験と内治療成果を評価する電位との比較のための簡単な方法を提供します。
半自動化された方法で FABP4 の定量化は、多くのドナーの場合とサンプルの間で客観性と分析の再現性をできます。さらにラベルは細胞質、それすることができます潜在的肥満研究のかなりの重要性のある区別過形成 (脂肪細胞数の増加) に加え肥大 (脂肪細胞サイズの拡大) を分析するため、肥大が強く脂肪肥満個人21障害に関連付けられて。肥満の伝染病はかなりの量の脂質ストレージを制御することができる薬剤を識別するの関心に拍車をかけています。この FABP4 アッセイは、何千もの脂肪蓄積を抑制する機能のための化合物のスクリーニングのため単純な読み出しを提供します。
The authors have nothing to disclose.
脂肪組織や研究の専門家を収集し、私たちにこのリソースを提供する研究用のドナーに感謝しております。アラガン社による支援の資金を確認したいと思います。Videoing とこの資料の提出のための編集のコストの資金調達もオークランド大学、医学部、健康科学パフォーマンス ベース研究基金に感謝しています。
Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |