Флуорометрия с фиксацией напряжения в<em> Xenopus</em> Ооциты с использованием флуоресцентных неестественных аминокислот
Summary
В этой статье описывается усовершенствование традиционной флюорометрии с напряжением (VCF), в которой вместо малеимидных красителей используются флуоресцентные неестественные аминокислоты (fUAA), чтобы исследовать структурные перестройки в ионных каналах. Процедура включает в себя инъекцию ДНК ооцита Xenopus, совместную инъекцию РНК / fUAA и одновременные измерения тока и флуоресценции.
Abstract
Флюорометрия с напряжением питания (VCF) была методом выбора для исследования структуры и функции белков электрогенной мембраны, где измерения флуоресценции и тока в реальном времени одновременно сообщают о локальных перестановках и глобальных функциях, соответственно 1 . В то время как структурные методы с высоким разрешением, такие как криоэлектронная микроскопия или рентгеновская кристаллография, обеспечивают статические изображения интересующих белков, VCF обеспечивает динамические структурные данные, которые позволяют связать структурные перестройки (флуоресценцию) с динамическими функциональными данными (электрофизиологию). До недавнего времени тиол-реактивная химия, используемая для сайт-направленного флуоресцентного мечения белков, ограничивала рамки подхода, поскольку все доступные цистеины, включая эндогенные, будут маркироваться. Таким образом, было необходимо сконструировать белки, свободные от эндогенных цистеинов. Маркировка также ограничивалась сайтами, доступными из внеклеточногобоковая сторона. Это изменилось с использованием флуоресцентных неестественных аминокислот (fUAA), чтобы специфически включить небольшой флуоресцентный зонд в ответ на подавление стоп-кодонов с использованием ортогональной пары тРНК и тРНК-синтетазы 2 . Для улучшения VCF требуется только двухступенчатая инъекционная инъекция ДНК (пара тРНК / синтетаза) с последующей совместной инъекцией РНК / fUAA. Теперь возможно маркировать как внутриклеточные, так и вложенные сайты, и использование VCF значительно расширилось. Таким образом, метод VCF становится привлекательным для изучения широкого спектра белков и, что еще важнее, позволяет исследовать многочисленные цитозольные регуляторные механизмы.
Introduction
Более 200 неестественных аминокислот с различными химическими и физическими свойствами были генетически включены в белки в клетках E. coli , дрожжах и клетках млекопитающих 3 . Неестественная аминокислота вводится в ответ на специфический стоп-кодон через пару ортогональных инженерии тРНК / синтетаза. Генетический подход к модификации белков дал ценную информацию о структуре и функциях белка. Здесь мы представляем протокол для использования Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) в сочетании с флуоресцентным UAA.
В VCF одновременное наблюдение функциональных данных и структурных перестроек, локализованных вокруг флуоресцентного зонда (~ 5 Å), позволяет получать динамическую информацию с миллисекундным разрешением 1 . Флуоресцентные зонды изменяют свое состояние гашения при локализованном движении белка. Движения только 1-2 Å достаточно, чтобы привести к значительным изменениям флуоресценцииИнтенсивность 4 . После идентификации сайта, представляющего интерес для целевого белка, сайт мутирован точечной мутацией. Классически остаток был мутирован до цистеина, тогда как теперь для включения генетического fUAA вводится янтарный стоп-кодон (TAG). Белок затем транскрибируется in vitro .
В то время как другие системы экспрессии ( например, клетки млекопитающих) могут быть использованы 5 , 6 , 7 , ооциты Xenopus являются предпочтительными для изучения структурно-функциональных функций из-за их большего размера, что приводит к более легким манипуляциям и более высокой интенсивности флуоресценции (больше флуорофоров) Шум. Кроме того, ооциты Xenopus имеют низкий фон от эндогенных белков 2 , 8 , а темная пигментация на полюсах животных защищает от фоновой флуоресценции от tОн цитозоль. Ооциты Xenopus удаляют хирургическим путем и ДНК, кодирующую парную ортогональную тРНК / тРНК-синтетазу, специфичную для fUAA, инъецируют в ядро ооцитов. Через 6-24 часа инкубации белковая РНК вводится совместно с fUAA в цитозоль ооцитов с последующим инкубационным периодом в 2-3 дня. Чтобы предотвратить любое повреждение fUAA (фотообесцвечивание), процедуры, включая Anap, должны выполняться под красным светом, чтобы избежать возбуждения флуорофора.
Ооциты изучаются на открытой срезе напряжения ооцита, установленной на вертикальном флуоресцентном микроскопе, и одновременно регистрируют изменения электрического тока и флуоресценции 9 , 10 . Альтернативно, можно использовать двухэлектродный зажим 1 напряжения или конфигурации 11 зажимных зажимов. Флуоресценция возбуждается соответствующими длинами волн с низким среднеквадратическим шумом и Записанного с использованием фотодиода, связанного с усилителем с высоким усилением.
Есть несколько преимуществ использования флуоресцентных неестественных аминокислот (fUAAs) в флюорометрии с зажимным напряжением. Одним из них является доступ к цитозольной стороне мембранных белков; Здесь расположены многие регуляторные процессы ( например, Са 2+ – или сайты связывания нуклеотидов, быстрая и закрытая инактивация ионно-канальных каналов с напряжением, открытие пор, модульная связь). Все эти процессы теперь доступны для флуоресцентной маркировки.
Другим преимуществом является небольшой размер зонда, приводящий к меньшему нарушению белка. До настоящего времени были разработаны две пары ортогональных тРНК / тРНК синтетаз для фуАА, 12 , где 3- (6-ацетилнафталин-2-иламино) -2-аминопропановая кислота (Anap) является единственным fUAA, который был использован в ооцитах Xenopus 2 ,"Xref"> 8. Анап является экологически чувствительным флуорофором с молекулярной массой 272,3 г / моль и лишь немного больше, чем триптофан 12 ( фиг.1А, 1В ). Из-за его небольших размеров флуорофором может быть введено меньше стерических эффектов по сравнению с обычными флуорофорами, прикрепленными через линкер (обычно более 500 г / моль). Более того, в случае Anap, флуорофор расположен ближе к основной белковой цепи, чем те, которые связаны с цистеинами, и, следовательно, Anap исследует более локализованные перестройки. Наконец, удаление эндогенных цистеинов в традиционном VCF для обеспечения специфичной для сайта маркировки больше не является требованием в UAA-VCF и, следовательно, (i) оставляет белки в (почти) их природном состоянии и (ii) позволяет применять VCF Для изучения более широкого диапазона белков, в которых функция может быть изменена путем замены цистеина.
<img alt="Рисунок 1" src = "/ files / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg" />
Рисунок 1 : Анап и спектры флуоресценции. ( A ) Химическая структура Anap. ( B ) Нормализованный спектр поглощения и спектры излучения для 1 нМ Anap, демонстрирующие чувствительность флуоресценции Anap к гидрофобности растворителя. Спектры излучения были получены возбуждением при 350 нм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Недостатком использования флуоресцентных UAAs является то, что гетерогенная популяция белков может быть результатом считывания стоп-кодона, трансляционной реинициации, С-концевых укороченных белков или перекрестных помех с эндогенным аминоацилированием, если количество аминоацилированных тРНК является недостаточным. Такое выражение утечки должно всегда проверяться на отсутствие пары fUAA и тРНК / тРНК синтетазы. Мы рассмотрели вопрос о трансИ как его обойти для N-терминальных сайтов вставки ранее 14 . Однако, когда fUAA, тРНК и тРНК синтетаза присутствуют в насыщенных количествах, остается только низкая вероятность выделения утечки.
Основной процедурной разницей между fUAA-VCF и традиционной VCF является инъекция и обращение с ооцитами; После инъекции ДНК, кодирующей тРНК и тРНК-синтетазу (pAnap), следует введение Anap, который либо совместно инъецируется с белковой мРНК, либо альтернативно добавляется к инкубационному раствору в виде ацетоксиметилового (AM) сложного эфира.
Protocol
Representative Results
Discussion
Аминоацилирование in vivo тРНК, которое непрерывно транскрибируется вместе с тРНК-синтетазой, позволяет получать высокие уровни экспрессии для измерений флуоресценции. Для эффективного включения fUAA важно, чтобы pAnap правильно вводился в ядро. Из-за неопределенности точного местопол…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PAnap был добрым подарком от доктора Питера Шульца (исследовательский институт Скриппса). Эта работа финансировалась Канадскими институтами исследований в области здравоохранения Гранты MOP-102689 и MOP-136894 (для РБ) и Канадским фондом инновационных грантов 950-225005.
Materials
| Solutions | |||
| Barth's solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 90mM |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | 3mM |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-9397 | 0.82mM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C-7902 | 0.41mM |
| Ca(NO3)2 | Sigma-Aldrich | C-1396 | 0.33mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5mM |
| NaOH hydrate | BDH | BDH7225-4 | pH 7.6 |
| Penicilin | Invitrogen | 15140122 | 100U/mL |
| Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | 100µg/mL |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160054 | 10mg/100mL |
| Horse serum | Invitrogen | 16050122 | 5% |
| SOS Standard Oocyte Solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | 102 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | 3 mM |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | 1 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| External recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Internal recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Labeling solution | |||
| KOH | Fisher Scientific | P250-1 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| TMR stock solution | |||
| Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR) | Molcular Probes by Life Technologies | T6027 | 5mM in DMSO |
| Anap stock solution | |||
| Anap | ABZENA (TCRS) | Custom synthesis TCRS-170 | 1mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1N |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| pAnap | Addgene | 48696 | |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan Corporation | CA-1B | |
| Gpatch Acquisition software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Analysis software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Recording Chamber | Custom machined | ||
| Photo diode detection system | Dagan Corporation | PhotoMax-200/PIN | |
| Electrical shutter driver | UNIBLITZ | VCM-D1 | |
Referenzen
- Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).
- Xiao, H., Schultz, P. G. At the Interface of Chemical and Biological Synthesis: An Expanded Genetic Code. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (9), (2016).
- Blunck, R. Chapter 9. Handbook of Ion Channels. , 113-133 (2015).
- Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
- DeBerg, H. A., Brzovic, P. S., Flynn, G. E., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structure and Energetics of Allosteric Regulation of HCN2 Ion Channels by Cyclic Nucleotides. J Biol Chem. 291 (1), 371-381 (2016).
- Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
- Aman, T. K., Gordon, S. E., Zagotta, W. N. Regulation of CNGA1 Channel Gating by Interactions with the Membrane. J Biol Chem. 291 (19), 9939-9947 (2016).
- Haddad, G. A., Blunck, R. Mode shift of the voltage sensors in Shaker K+ channels is caused by energetic coupling to the pore domain. J Gen Physiol. 137 (5), 455-472 (2011).
- Batulan, Z., Haddad, G. A., Blunck, R. An intersubunit interaction between S4-S5 linker and S6 is responsible for the slow off-gating component in Shaker K+ channels. J Biol Chem. 285 (18), 14005-14019 (2010).
- Kusch, J., et al. How subunits cooperate in cAMP-induced activation of homotetrameric HCN2 channels. Nat Chem Biol. 8 (2), 162-169 (2012).
- Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
- Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Reinitiation at non-canonical start codons leads to leak expression when incorporating unnatural amino acids. Sci Rep. 5, 11866 (2015).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).
- Beckert, B., Masquida, B. Synthesis of RNA by in vitro transcription. Methods Mol Biol. 703, 29-41 (2011).
- Goldin, A. L. Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection. Methods Enzymol. 207, 266-279 (1992).
- Rudokas, M. W., Varga, Z., Schubert, A. R., Asaro, A. B., Silva, J. R. The Xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Zhao, J., Blunck, R. The isolated voltage sensing domain of the Shaker potassium channel forms a voltage-gated cation channel. Elife. 5, (2016).
- Posson, D. J., Ge, P., Miller, C., Bezanilla, F., Selvin, P. R. Small vertical movement of a K+ channel voltage sensor measured with luminescence energy transfer. Nature. 436 (7052), 848-851 (2005).
- Chanda, B., Asamoah, O. K., Blunck, R., Roux, B., Bezanilla, F. Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement. Nature. 436 (7052), 852-856 (2005).
- Taraska, J. W., Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Short-distance probes for protein backbone structure based on energy transfer between bimane and transition metal ions. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16227-16232 (2009).
- Baker, B. J., et al. Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 53-67 (2008).
- Miranda, P., et al. State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T. Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids. Methods. 36 (3), 270-278 (2005).
- Hohsaka, T., Ashizuka, Y., Murakami, H., Sisido, M. Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins. Nucleic Acids Res. 29 (17), 3646-3651 (2001).
