Fluorométrie de tension-serre dans<em> Xenopus</em> Oocytes utilisant des acides aminés fluorescents non naturels
Summary
Cet article décrit une amélioration de la Fluorométrie conventionnelle en tension-clamp (VCF) où les acides aminés non naturels fluorescents (fUAA) sont utilisés à la place des colorants maléimidés, pour sondage des réarrangements structurels dans les canaux ioniques. La procédure comprend l'injection d'ADN ovocytaire de Xenopus, la co-injection d'ARN / fUAA et les mesures simultanées de courant et de fluorescence.
Abstract
La Fluorométrie de la Tension-Clamp (VCF) a été la technique de choix pour étudier la structure et la fonction des protéines de la membrane électrogène, où les mesures en temps réel de la fluorescence et des courants rapportent simultanément sur les réarrangements locaux et la fonction globale, respectivement 1 . Alors que les techniques structurelles à haute résolution telles que la microscopie cryo-électronique ou la cristallographie aux rayons X fournissent des images statiques des protéines d'intérêt, VCF fournit des données structurelles dynamiques qui nous permettent de relier les réarrangements structurels (fluorescence) aux données fonctionnelles dynamiques (électrophysiologie). Jusqu'à récemment, la chimie réactif au thiol utilisée pour l'étiquetage fluorescent dirigé par le site des protéines a limité la portée de l'approche car toutes les cystéines accessibles, y compris les endogènes, seront étiquetées. Il était donc nécessaire de construire des protéines exemptes de cystéines endogènes. L'étiquetage était également limité aux sites accessibles à partir de l'extracellulairecôté. Cela a changé avec l' utilisation d'acides aminés non naturels fluorescents (fUAA) pour incorporer spécifiquement une petite sonde fluorescente en réponse à la suppression du codon d'arrêt en utilisant une paire ARNt et tRNA synthetase orthogonal 2 . L'amélioration du VCF nécessite seulement une procédure d'injection en deux étapes de l'injection d'ADN (paire d'ARNt / synthetase) suivie d'une co-injection d'ARN / fUAA. Maintenant, l'étiquetage des sites intracellulaires et enterrés est possible et l'utilisation de VCF a considérablement augmenté. La technique VCF devient ainsi attrayante pour l'étude d'une large gamme de protéines et, plus important encore, permet d'enquêter sur de nombreux mécanismes de régulation cytosolique.
Introduction
Plus de 200 acides aminés non naturels de diverses propriétés chimiques et physiques ont été incorporés génétiquement dans les protéines dans les cellules de E. coli , de levure et de mammifères 3 . L'acide aminé non naturel est incorporé en réponse à un codon d'arrêt spécifique par une paire d'ARNt / synthetase modifiée par voie orthogonale. L'approche génétique de la modification des protéines a fourni des informations précieuses sur la structure et la fonction des protéines. Ici, nous présentons un protocole d'utilisation de la Fluorométrie de tension-clamp (VCF) en combinaison avec une SAU fluorescente.
Dans VCF, l'observation simultanée de données fonctionnelles et de réarrangements structurels localisés autour de la sonde fluorescente (~ 5 Å) nous permet d'obtenir des informations dynamiques avec une résolution de milliseconde 1 . Les sondes fluorescentes modifient leur état de trempe lors d'un mouvement localisé de la protéine. Un mouvement de seulement 1-2 Å est suffisant pour conduire à des changements significatifs dans la fluorescenceIntensité 4 . Après l'identification du site d'intérêt dans la protéine cible, le site est muté par mutation ponctuelle. Classiquement, le résidu a été muté à une cystéine alors que maintenant, un codon d'arrêt ambré (TAG) est introduit pour l'incorporation de fUAA génétique. La protéine est ensuite transcrit in vitro .
Alors que d'autres systèmes d'expression ( p. Ex., Cellules de mammifères) peuvent être utilisés 5 , 6 , 7 , les ovocytes de Xenopus sont préférables pour les études de structure-fonction en raison de leur taille plus grande, conduisant à une manipulation plus facile et une plus grande intensité de fluorescence (plus de fluorophores) et, par conséquent, Rapport bruit-bruit. De plus, les ovocytes de Xenopus ont un faible effet de fond sur les protéines endogènes 2 , 8 et la pigmentation sombre sur les écussons des poteaux animaux contre la fluorescence de fond de tIl cytosol. Les ovocytes Xenopus sont éliminés chirurgicalement et l'ADN codant pour la paire orthogonale d'ARNt / tRNA-synthetase spécifique pour le fUAA est injecté dans le noyau des ovocytes. Après un temps d'incubation de 6 à 24 heures, l'ARN de la protéine est co-injecté avec le fUAA dans le cytosol des ovocytes, suivi d'une période d'incubation de 2 à 3 jours. Afin d'éviter tout dommage au fUAA (photoblanchage), les procédures incluant Anap doivent être effectuées sous la lumière rouge pour éviter l'excitation des fluorophores.
Les ovocytes sont étudiés sur une installation de tension-clamp d'ovocytes coupées, qui est montée sur un microscope de fluorescence vertical, et le courant électrique et les changements de fluorescence sont enregistrés simultanément 9 , 10 . Alternativement, on peut utiliser une pince de tension à deux électrodes 1 ou des configurations de bridage-bride 11 . La fluorescence est excitée par des longueurs d'onde appropriées avec un faible bruit RMS et Émission enregistrée à l'aide d'une photodiode liée à un amplificateur avec une amplification élevée.
Il existe plusieurs avantages de l'utilisation d'acides aminés non naturels fluorescents (fUAA) dans la fluorométrie tension-clamp. L'une est l'accès au côté cytosolique des protéines membranaires; De nombreux processus réglementaires sont situés ici ( p. Ex. Sites de liaison au Ca 2+ ou aux nucléotides, inactivation rapide et à l'état de fermeture des canaux ioniques à tension, ouverture des pores, couplage du module). Tous ces processus sont maintenant accessibles pour l'étiquetage fluorescent.
Un autre avantage est la petite taille de la sonde conduisant à moins de perturbation de la protéine. Jusqu'à présent, deux paires orthogonales d'ARNt / tRNA synthetase pour les FUAA ont été conçues 12 , 13 , où l'acide 3- (6-acétylnaphtalène-2-ylamino) -2-aminopropanoïque (Anap) est le seul fUAA qui a été utilisé dans les ovocytes Xenopus 2 ,"Xref"> 8. Anap est un fluorophore respectueux de l'environnement avec un poids moléculaire de 272,3 g / mol et n'est que légèrement plus grand que le tryptophane 12 ( figures 1A, 1B ). En raison de sa petite taille, moins d'effets stériques sont susceptibles d'être introduits par le fluorophore par rapport aux fluorophores classiques fixés via un lieur (typiquement plus de 500 g / mol). De plus, dans le cas d'Anap, le fluorophore est situé plus près du squelette de la protéine que ceux liés aux cystéines, et par conséquent, Anap sondage des réarrangements plus localisés. Enfin, l'élimination des cystéines endogènes dans le VCF conventionnel afin d'assurer l'étiquetage spécifique du site n'est plus une exigence dans l'UAA-VCF et donc (i) laisse les protéines dans (presque) leur état natif et (ii) permet l'application de VCF Pour étudier une gamme plus large de protéines dans laquelle la fonction peut être modifiée par la substitution de cysteine.
<img alt="Figure 1" src = "/ files / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg" />
Figure 1 : Spectre Anap et Fluorescence. ( A ) Structure chimique d'Anap. ( B ) spectre d'absorption normalisé et spectres d'émission pour 1 nM Anap, démontrant la sensibilité de la fluorescence Anap à l'hydrophobicité du solvant. Les spectres d'émission ont été obtenus en excitant à 350 nm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Un inconvénient de l'utilisation de SAU fluorescentes est qu'une population hétérogène de protéines peut résulter d'une lecture à distance de codon, d'une réinitiation translationnelle, de protéines tronquées C-terminales ou de diaphonie avec une aminoacylation endogène si la quantité d'ARNt aminoacylés est rare. Une telle expression de fuite doit toujours être vérifiée en l'absence du fUAA et de la paire tRNA / tRNA synthetase. Nous avons abordé la question de transLa réinitialisation lationnelle et comment la contourner pour les sites d'insertion N-terminaux précédemment 14 . Cependant, lorsque le fUAA, l'ARNt et l'ARNt synthetase sont présents en quantités saturées, il ne reste qu'une faible probabilité d'expression de fuite.
La principale différence de procédure entre fUAA-VCF et VCF conventionnel est l'injection et la manipulation des ovocytes; L'injection d'ADN codant pour l'ARNt et l'ARNt synthetase (pAnap) est suivie de l'introduction d'Anap, qui est soit co-injecté avec l'ARNm de protéine, soit ajouté à la solution d'incubation sous la forme d'un ester acétoxyméthyl (AM).
Protocol
Representative Results
Discussion
L'aminoacylation in vivo des ARNt qui sont transcrites en continu avec l'ARNt-synthetase permet d'obtenir des niveaux d'expression élevés pour les mesures de fluorescence. Pour une incorporation fUAA efficace, il est essentiel que pAnap soit correctement injecté dans le noyau. En raison de l'incertitude quant à l'emplacement exact du noyau, 10 à 40% des injections d'ADN devraient échouer, ce qui entraîne des ovocytes non exprimant (ou exprimant des fuites). Par conséquent, il…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PAnap était un cadeau génial du Dr Peter Schultz (Scripps Research Institute). Ce travail a été financé par les Instituts du Canada pour subventions de recherche en santé MOP-102689 et MOP-136894 (à RB) et la Fondation canadienne pour l'innovation 950-225005.
Materials
| Solutions | |||
| Barth's solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 90mM |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | 3mM |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-9397 | 0.82mM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C-7902 | 0.41mM |
| Ca(NO3)2 | Sigma-Aldrich | C-1396 | 0.33mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5mM |
| NaOH hydrate | BDH | BDH7225-4 | pH 7.6 |
| Penicilin | Invitrogen | 15140122 | 100U/mL |
| Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | 100µg/mL |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160054 | 10mg/100mL |
| Horse serum | Invitrogen | 16050122 | 5% |
| SOS Standard Oocyte Solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | 102 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | 3 mM |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | 1 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| External recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Internal recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Labeling solution | |||
| KOH | Fisher Scientific | P250-1 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| TMR stock solution | |||
| Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR) | Molcular Probes by Life Technologies | T6027 | 5mM in DMSO |
| Anap stock solution | |||
| Anap | ABZENA (TCRS) | Custom synthesis TCRS-170 | 1mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1N |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| pAnap | Addgene | 48696 | |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan Corporation | CA-1B | |
| Gpatch Acquisition software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Analysis software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Recording Chamber | Custom machined | ||
| Photo diode detection system | Dagan Corporation | PhotoMax-200/PIN | |
| Electrical shutter driver | UNIBLITZ | VCM-D1 | |
Referenzen
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