Spanningsklem Fluorometrie in<em> Xenopus</em> Oocyten Met Fluorescerende Onnatuurlijke Aminozuren
Summary
Dit artikel beschrijft een versterking van conventionele Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) waar Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) worden gebruikt in plaats van maleimide kleurstoffen, om structurele herrangschikkingen in ionenkanalen te onderzoeken. De procedure omvat Xenopus oocyt DNA injectie, RNA / fUAA coinjection, en gelijktijdige stroom en fluorescentie metingen.
Abstract
Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) is de gewenste techniek om de structuur en functie van elektrogenische membraanproteïnen te onderzoeken, waarbij real-time metingen van fluorescentie en stromingen gelijktijdig rapporteren over lokale omgevingen en globale functie respectievelijk 1 . Terwijl hoge-resolutie structurele technieken zoals cryo-elektronenmicroscopie of röntgenkristallografie statische beelden van de eiwitten van belang bieden, biedt VCF dynamische structurele gegevens die ons in staat stellen de structurele omzettingen (fluorescentie) te koppelen aan dynamische functionele data (elektrofysiologie). Tot voor kort beperkte de thiol-reactieve chemie die wordt gebruikt voor plaatsgerichte fluorescente etikettering van de eiwitten de reikwijdte van de aanpak, omdat alle toegankelijke cysteinen, waaronder endogene, worden gemerkt. Het was derhalve verplicht om eiwitten vrij te maken van endogene cysteinen. Etikettering was ook beperkt tot sites die toegankelijk waren voor de extracellulairekant. Dit veranderde met behulp van Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) om specifiek een kleine fluorescerende sonde in te nemen in reactie op stopcodononderdrukking met behulp van een orthogonale tRNA en tRNA synthetase pair 2 . De VCF-verbetering vereist alleen een tweetraps injectieprocedure van DNA-injectie (tRNA / synthetase-paar) gevolgd door RNA / fUAA co-injectie. Nu is het mogelijk om zowel intracellulaire als begraafde plaatsen te labelen, en het gebruik van VCF is aanzienlijk uitgebreid. De VCF techniek wordt daardoor aantrekkelijk voor het bestuderen van een breed scala van eiwitten en – nog belangrijker – maakt het mogelijk om talloze cytosolische regulerende mechanismen te onderzoeken.
Introduction
Meer dan 200 onnatuurlijke aminozuren van verschillende chemische en fysische eigenschappen zijn genetisch in eiwitten opgenomen in E. coli , gist en zoogdiercellen 3 . Het onnatuurlijke aminozuur is opgenomen in reactie op een specifiek stopcodon via een orthogonaal ontwikkeld tRNA / synthetasepaar. De genetische benadering van het modificeren van eiwitten heeft waardevolle inzichten gegeven in eiwitstructuur en -functie. Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) in combinatie met een fluorescerende UAA.
In VCF staat de gelijktijdige observatie van functionele data en structurele omgevingen rond de fluorescerende sonde (~ 5 Å) ons in staat dynamische informatie te verkrijgen met millisecondresolutie 1 . De fluorescerende probes veranderen hun blusstaat op gelokaliseerde beweging van het eiwit. Een beweging van slechts 1-2 Å is voldoende om te leiden tot significante veranderingen in de fluorescentieIntensiteit 4 . Na identificatie van de bezienswaardigheid in het doelproteïne wordt de plaats gemuteerd door puntmutatie. Klassiek was het residu gemuteerd naar een cysteïne, terwijl nu een amber stopcodon (TAG) geïntroduceerd wordt voor genetische fUAA-incorporation. Het eiwit wordt vervolgens in vitro getranscribeerd.
Terwijl andere expressiesystemen (bijvoorbeeld zoogdiercellen) 5 , 6 , 7 kunnen gebruiken, hebben Xenopus- oocyten de voorkeur aan structurele-functiestudies vanwege hun grotere grootte, wat leidt tot eenvoudiger manipulatie en hogere fluorescentie-intensiteit (meer fluorophoren) Ruisverhouding. Bovendien hebben Xenopus- oocyten lage achtergrond van endogene eiwitten 2 , 8 en de donkere pigmentatie op de dierenpoolschilden tegen achtergrondfluorescentie van tHij cytosol. De Xenopus- oocyten worden chirurgisch verwijderd en DNA dat codeert voor het orthogonale tRNA / tRNA-synthetase-paar dat specifiek is voor het fUAA, wordt geïnjecteerd in de kern van de oocyten. Na een incubatietijd van 6-24 uur wordt het eiwit RNA gecojecteerd met het fUAA in het cytosol van de oocyten, gevolgd door een incubatieperiode van 2-3 dagen. Om eventuele schade aan de fUAA te voorkomen (fotobladen) moeten de procedures inclusief Anap onder rood worden uitgevoerd om fluorofore excitatie te vermijden.
Oocyten worden bestudeerd op een open-oocyte spanningsklemopstelling, die op een oprechte fluorescentiemicroscoop is gemonteerd. Elektrische stroom- en fluorescentieveranderingen worden gelijktijdig opgenomen 9 , 10 . Als alternatief kunnen twee-elektrode spanningsklem 1 of patch-klemconfiguraties 11 gebruikt worden. Fluorescentie wordt opgewonden door geschikte golflengten met laag RMS geluid en Emissie opgenomen met behulp van een fotodiode gekoppeld aan een versterker met hoge amplificatie.
Er zijn verschillende voordelen van het gebruik van fluorescerende onnatuurlijke aminozuren (fUAA's) in spanningsfluurometrie. Eén is toegang tot de cytosolische zijde van de membraanproteïnen; Veel reguleringsprocessen zijn hier gevestigd ( bijv. Ca 2+ – of nucleotidebindingsplaatsen, snelle en gesloten toestand-inactivering van spanningsgated ionkanalen, porieopening, modulekoppeling). Al deze processen zijn nu toegankelijk voor fluorescerende etikettering.
Een ander voordeel is de kleine maat van de sonde, wat leidt tot minder verstoring van het eiwit. Tot nu toe zijn twee orthogonale tRNA / tRNA synthetaseparen voor fUAA's 12 , 13 ontwikkeld, waar 3- (6-acetylnaphthalen-2-ylamino) -2-aminopropaanzuur (Anap) de enige fUAA is die in Xenopus- oocyten is gebruikt 2 ,"Xref"> 8. Anap is een milieuvriendelijke fluorofoor met een molecuulgewicht van 272,3 g / mol en is slechts iets groter dan tryptofaan 12 ( figuren 1A, 1B ). Vanwege zijn kleine grootte worden waarschijnlijk minder sterische effecten geïntroduceerd door de fluorofoor in vergelijking met conventionele fluoroforen die via een linker (meestal meer dan 500 g / mol) zijn verbonden. Bovendien is in het geval van Anap het fluorofoor dichter bij de eiwit backbone dan die gekoppeld aan cysteinen, en bijgevolg probeert Anap meer gelokaliseerde omgevingen. Ten slotte is de verwijdering van endogene cysteinen in conventionele VCF om site-specifieke etikettering te waarborgen niet langer een vereiste in UAA-VCF en derhalve (i) verlaat de eiwitten in (bijna) hun native state en (ii) staat VCF toe Een bredere reeks eiwitten bestuderen, waarin de functie kan worden veranderd door cysteïne substitutie.
<img alt="Figuur 1" src = "/ files / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg" />
Figuur 1 : Anap en Fluorescentie Spectra. ( A ) Chemische structuur van Anap. ( B ) Genormaliseerd absorptiespectrum en emissiespectra voor 1 nM Anap, waarbij de gevoeligheid van Anap fluorescentie aan de oplosmiddel hydrofobiciteit wordt aangetoond. Emissiespectra werden verkregen door spanning bij 350 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een nadeel van het gebruik van fluorescerende UAA's is dat een heterogene eiwitpopulatie kan voortvloeien uit stopcodon-doorbraak, translationele reinitiatie, C-terminale afgeknotte eiwitten of crosstalk met endogene aminoacylering als de hoeveelheid aminoacyleerde tRNA's schaars is. Dergelijke lekuitdrukking moet altijd gecontroleerd worden bij afwezigheid van het fUAA en het tRNA / tRNA synthetasepaar. We hebben het probleem van trans behandeldLational reinitiation en hoe te omzeilen voor N-terminale insertie sites eerder 14 . Wanneer echter het fUAA, tRNA en tRNA synthetase aanwezig zijn in verzadigde hoeveelheden, blijft er slechts een lage kans op lekuitdrukking.
Het belangrijkste procedurele verschil tussen fUAA-VCF en conventionele VCF is de injectie en behandeling van de oocyten; De injectie van DNA dat codeert voor het tRNA en het tRNA synthetase (pAnap) wordt gevolgd door de introductie van Anap, die ook gecojecteerd wordt met het eiwit mRNA of alternatief toegevoegd aan de incubatieoplossing als een acetoxymethyl (AM) ester.
Protocol
Representative Results
Discussion
De in vivo aminoacylatie van tRNA's die continu worden getranscribeerd met het tRNA-synthetase, maakt het mogelijk om hoge expressieniveaus te verkrijgen voor fluorescentiemetingen. Voor efficiënte fUAA-incorporation is het van kritiek belang dat pAnap correct in de kern wordt geïnjecteerd. Vanwege de onzekerheid van de exacte locatie van de kern wordt verwacht dat 10-40% van de DNA-injecties mislukt, wat resulteert in niet-expressieve (of lekkende expressie) oocyten. Daarom is het belangrijk om expressie…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PAnap was een aardig cadeau van dr. Peter Schultz (Scripps Research Institute). Dit werk werd gefinancierd door de Canadese Instituten voor Gezondheidsonderzoekstoelaes MOP-102689 en MOP-136894 (naar RB) en de Canadese Stichting Innovatie Grant 950-225005.
Materials
| Solutions | |||
| Barth's solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 90mM |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | 3mM |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-9397 | 0.82mM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C-7902 | 0.41mM |
| Ca(NO3)2 | Sigma-Aldrich | C-1396 | 0.33mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5mM |
| NaOH hydrate | BDH | BDH7225-4 | pH 7.6 |
| Penicilin | Invitrogen | 15140122 | 100U/mL |
| Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | 100µg/mL |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160054 | 10mg/100mL |
| Horse serum | Invitrogen | 16050122 | 5% |
| SOS Standard Oocyte Solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | 102 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | 3 mM |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | 1 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| External recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Internal recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Labeling solution | |||
| KOH | Fisher Scientific | P250-1 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| TMR stock solution | |||
| Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR) | Molcular Probes by Life Technologies | T6027 | 5mM in DMSO |
| Anap stock solution | |||
| Anap | ABZENA (TCRS) | Custom synthesis TCRS-170 | 1mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1N |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| pAnap | Addgene | 48696 | |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan Corporation | CA-1B | |
| Gpatch Acquisition software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Analysis software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Recording Chamber | Custom machined | ||
| Photo diode detection system | Dagan Corporation | PhotoMax-200/PIN | |
| Electrical shutter driver | UNIBLITZ | VCM-D1 | |
Referenzen
- Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).
- Xiao, H., Schultz, P. G. At the Interface of Chemical and Biological Synthesis: An Expanded Genetic Code. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (9), (2016).
- Blunck, R. Chapter 9. Handbook of Ion Channels. , 113-133 (2015).
- Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
- DeBerg, H. A., Brzovic, P. S., Flynn, G. E., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structure and Energetics of Allosteric Regulation of HCN2 Ion Channels by Cyclic Nucleotides. J Biol Chem. 291 (1), 371-381 (2016).
- Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
- Aman, T. K., Gordon, S. E., Zagotta, W. N. Regulation of CNGA1 Channel Gating by Interactions with the Membrane. J Biol Chem. 291 (19), 9939-9947 (2016).
- Haddad, G. A., Blunck, R. Mode shift of the voltage sensors in Shaker K+ channels is caused by energetic coupling to the pore domain. J Gen Physiol. 137 (5), 455-472 (2011).
- Batulan, Z., Haddad, G. A., Blunck, R. An intersubunit interaction between S4-S5 linker and S6 is responsible for the slow off-gating component in Shaker K+ channels. J Biol Chem. 285 (18), 14005-14019 (2010).
- Kusch, J., et al. How subunits cooperate in cAMP-induced activation of homotetrameric HCN2 channels. Nat Chem Biol. 8 (2), 162-169 (2012).
- Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
- Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Reinitiation at non-canonical start codons leads to leak expression when incorporating unnatural amino acids. Sci Rep. 5, 11866 (2015).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).
- Beckert, B., Masquida, B. Synthesis of RNA by in vitro transcription. Methods Mol Biol. 703, 29-41 (2011).
- Goldin, A. L. Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection. Methods Enzymol. 207, 266-279 (1992).
- Rudokas, M. W., Varga, Z., Schubert, A. R., Asaro, A. B., Silva, J. R. The Xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Zhao, J., Blunck, R. The isolated voltage sensing domain of the Shaker potassium channel forms a voltage-gated cation channel. Elife. 5, (2016).
- Posson, D. J., Ge, P., Miller, C., Bezanilla, F., Selvin, P. R. Small vertical movement of a K+ channel voltage sensor measured with luminescence energy transfer. Nature. 436 (7052), 848-851 (2005).
- Chanda, B., Asamoah, O. K., Blunck, R., Roux, B., Bezanilla, F. Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement. Nature. 436 (7052), 852-856 (2005).
- Taraska, J. W., Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Short-distance probes for protein backbone structure based on energy transfer between bimane and transition metal ions. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16227-16232 (2009).
- Baker, B. J., et al. Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 53-67 (2008).
- Miranda, P., et al. State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T. Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids. Methods. 36 (3), 270-278 (2005).
- Hohsaka, T., Ashizuka, Y., Murakami, H., Sisido, M. Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins. Nucleic Acids Res. 29 (17), 3646-3651 (2001).
