Voltaj kelepçesi florometrisi<em> Xenopus</emFloresan Doğal Olmayan Amino Asitler Kullanan Oositler
Summary
Bu makale, iyon kanallarındaki yapısal yeniden düzenlenmeleri araştırmak için maleimid boyaları yerine Floresan Doğal olmayan Amino Asitlerin (fUAA) kullanıldığı klasik Voltaj-Kelepçe Florometrisinin (VCF) geliştirilmesini anlatıyor. Prosedür, Xenopus oosit DNA enjeksiyonu, RNA / fUAA koinjeksiyon ve eşzamanlı akım ve flüoresans ölçümlerini içerir.
Abstract
Gerilim-Kelepçe Fluorometri (VCF), gerçek zamanlı floresan ve akım ölçümlerinin sırasıyla lokal düzenlenmeler ve küresel işlev üzerine rapor verdiği elektrojenik membran proteinlerinin yapısını ve fonksiyonunu araştırmak için tercih edilen bir tekniktir. Kriyo elektron mikroskopisi veya X-ışını kristalografisi gibi yüksek çözünürlüklü yapısal teknikler ilgi proteinlerin statik görüntülerini sağlarken, VCF yapısal yeniden düzenlenmeleri (flüoresan) dinamik fonksiyonel verilere (elektrofizyoloji) bağlamamızı sağlayan dinamik yapısal veriler sağlar. Yakın zamana kadar, proteinlerin yer yönünde flüoresan etiketlemesi için kullanılan tiyol reaktif kimyası, yaklaşımın kapsamını kısıtladı, çünkü endojen olanlar da dahil erişilebilir sisteinler etiketlenecek. Dolayısıyla, endojen sisteinlerden bağımsız proteinler oluşturmak gerekiyordu. Etiketleme ayrıca, hücre dışıyan. Bu, ortogonal bir tRNA ve tRNA sentetaz çifti 2 kullanılarak durdurma kodonunun bastırılmasına yanıt olarak küçük bir fluoresan probu özel olarak dahil etmek için Floresan Doğal Olmayan Amino Asitler (fUAA) kullanılarak değiştirildi. VCF gelişimi sadece DNA enjeksiyonunun (tRNA / sentetaz çifti) iki aşamalı enjeksiyon prosedürüne ve ardından RNA / fUAA ko-enjeksiyonuna ihtiyaç duyar. Şimdi hem hücre içi hem de gömülü alanları etiketlemek mümkündür ve VCF kullanımı önemli ölçüde genişlemiştir. Bu nedenle, VCF tekniği geniş bir protein yelpazesinin incelenmesi için çekici hale gelir ve daha da önemlisi, çok sayıda sitosolik düzenleyici mekanizmanın araştırılmasına izin verir.
Introduction
Çeşitli kimyasal ve fiziksel özelliklerin 200'den fazla doğal olmayan amino asitleri genetik olarak E. coli , maya ve memeli hücrelerindeki proteinlere dahil edilmiştir 3 . Doğal olmayan amino asit, ortogonal olarak tasarlanmış bir tRNA / sentetaz çiftiyle belirli bir durdurma kodonuna tepki olarak dahil edilir. Proteinleri değiştirmek için genetik yaklaşım, protein yapısına ve işlevine değerli bilgiler sağlamıştır. Burada, Gerilim-Kelepçe Florometrini (VCF) floresan bir UAA ile kombine etmek için bir protokol sunuyoruz.
VCF'de, flüoresan prob etrafında lokalize olan fonksiyonel verilerin ve yapısal yeniden düzenlemelerin aynı anda gözlemlenmesi (~ 5 Å), milisaniye çözünürlük 1 ile dinamik bilgi elde etmemize izin verir. Flüoresan problar, lokalize protein hareketi üzerine söndürme durumunu değiştirir. Sadece 1-2 A'lık bir hareket, flüoresanda önemli değişiklikler yaratmaya yeterlidirYoğunluk 4 . Hedef proteindeki ilgi alanının belirlenmesinden sonra, site nokta mutasyonu ile mutasyona uğratılmıştır. Klasik olarak, tortu bir sisteine dönüştürüldü, oysa şimdi, amber stop kodonu (TAG) genetik fUAA'nın birleşmesi için eklendi. Protein daha sonra in vitro olarak kopyalanır.
Xenopus oositleri, daha büyük manipülasyona ve daha yüksek floresans yoğunluğuna (daha fazla florofor) yol açan, yapı fonksiyonu çalışmaları için tercih edilirken , diğer ifade sistemleri ( örneğin, memeli hücreleri) 5 , 6 , 7 kullanılabilirken, Gürültü oranı. Üstelik, Xenopus oositleri, 2 , 8 nolu endojen proteinlerden düşük arka plana ve hayvan kutbu kalkanlarında karanlık pigmentasyona karşı tSitosol. Xenopus oositleri cerrahi olarak çıkarılır ve fUAA için spesifik olan ortogonal tRNA / tRNA sentetaz çiftini kodlayan DNA, oositlerin çekirdeğine enjekte edilir. 6-24 saatlik inkübasyon süresinden sonra, protein RNA, oositlerin sitozolüne fUAA ile birlikte enjekte edilir, bunu 2-3 gün inkübasyon periyodu takip eder. FUAA'ya herhangi bir hasar vermemek için (foto-ağartma), florofor uyarımını önlemek için Anap dahil prosedürler kırmızı ışık altında gerçekleştirilmelidir.
Oositler dik bir flüoresan mikroskopta monte edilmiş kesilmiş açık oosit gerilim-kelepçe düzeneği üzerinde incelenir ve elektrik akımı ve floresans değişiklikleri aynı anda 9 , 10 olarak kaydedilir. Alternatif olarak, iki elektrotlu voltaj kelepçesi 1 veya yama-kelepçe konfigürasyonları 11 kullanılabilir. Floresans, düşük RMS gürültüsü olan uygun dalga boyları tarafından uyarılır ve Yüksek amplifikasyonlu bir amplifikatöre bağlı bir fotodiyot kullanılarak kaydedilen emisyon.
Gerilim-kelepçe florometride flüoresan doğal olmayan amino asitler (fUAAs) kullanmanın çeşitli avantajları vardır. Bir tanesi membran proteinlerinin sitosolik tarafına erişimdir; ( Örneğin, Ca 2+ – veya nükleotid bağlanma bölgeleri, voltaj kapılı iyon kanallarının hızlı ve kapalı halde inaktivasyonu, gözenek açma, modül bağlantısı). Tüm bu süreçlere flüoresan etiketleme için artık erişilebilir.
Bir diğer avantaj ise, proteinin daha az bozulmasına yol açan probun küçük boyutu olmasıdır. Şimdiye kadar, fUAAs için iki ortogonal tRNA / tRNA sentetaz çiftleri, Xenopus oositlerinde kullanılan tek fUAA olan 3- (6-asetilnaftalen-2-ilamino) -2-aminopropanoik asitin (Anap) 12,13 olduğu düşünülmüştür 2 ,"Xref"> 8. Anap, 272.3 g / mol molekül ağırlığına sahip ve sadece triptofan 12'den biraz daha büyük olan çevreye duyarlı bir florofordur ( Şekiller 1A, 1B ). Küçük boyundan ötürü, bir bağlayıcı vasıtasıyla bağlanan konvansiyonel fluoroforlara kıyasla (genelde 500 g / mol'den fazla) florofor tarafından daha az sterik etkinin ortaya çıkması muhtemeldir. Dahası, Anapa durumunda, flüorofor, sisteinlerle bağlantılı olanlardan daha protein omurgasına yakın konumda bulunur ve sonuç olarak, Anap daha fazla lokalize yeniden düzenleme istemektedir. Son olarak, bölgeye özgü etiketlemeyi sağlamak için konvansiyonel VCF'deki endojen sisteinlerin uzaklaştırılması, UAA-VCF'de artık gerekli değildir ve bu nedenle (i) proteinleri neredeyse kendi doğal hallerinde bırakır ve (ii) VCF'nin uygulanmasına izin verir Fonksiyonun sistein ikamesi ile değiştirilebildiği daha geniş bir protein aralığını incelemek.
<img alt="Şekil 1" src = "/ files / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg" />
Şekil 1 : Anap ve Floresans Spektrumu. ( A ) Anapın kimyasal yapısı. ( B ) Anap floresanının solventin hidrofobikliğine duyarlılığını gösteren 1 nM Anap için normalleştirilmiş absorpsiyon spektrumu ve emisyon spektrumu. Emisyon spektrumu, 350 nm'de heyecan verici şekilde elde edildi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Floresan UAAs'ın bir dezavantajı, aminoasillenmiş tRNA'ların miktarı azsa, durma kodonu okunması, translasyonel yeniden başlatma, C-terminali kesilmiş proteinler veya endojen aminoasilasyona sahip çapraz geçişten heterojen bir protein popülasyonunun oluşabilmesidir. Bu sızıntı ekspresyonu daima fUAA'nın ve tRNA / tRNA sentetaz çifti yokluğunda kontrol edilmelidir. Trans sorununu ele aldık.Lasyonel yeniden başlatma ve daha önce N-terminal ekleme siteleri için nasıl önüne geçileceği 14 . Bununla birlikte, fUAA, tRNA ve tRNA sentetaz doymuş miktarda mevcut olduğunda, sızıntı ekspresyonu olasılığı düşüktür.
FUAA-VCF ve konvansiyonel VCF arasındaki temel usul farkı, oositlerin enjeksiyonu ve taşınmasıdır; TRNA ve tRNA sentetazı (pAnap) kodlayan DNA'nın enjeksiyonu ya protein mRNA'yla birlikte enjekte edilen veya alternatif olarak bir asetoksimetil (AM) ester olarak inkübasyon solüsyonuna eklenen Anap'ın sokulması ile devam eder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sürekli olarak tRNA sentetaz ile transkribe edilen tRNA'ların in vivo aminoasilasyonu, floresan ölçümleri için yüksek ekspresyon seviyeleri elde etmeyi mümkün kılar. Etkin fUAA birleşimi için pAnap'ın çekirdeğe doğru enjekte edilmesi önemlidir. Çekirdeğin tam yerinin belirsizliği nedeniyle, DNA enjeksiyonlarının% 10-40'ında başarısız olması ve bunun da ifade edilmeyen (veya sızıntı ifade eden) oositlerin ortaya çıkması beklenir. Bu nedenle, sızıntı kanallarında m…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PAnap, Dr. Peter Schultz (Scripps Araştırma Enstitüsü) 'nin kibar bir hediyesiydi. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma Grants Enstitüleri MOP-102689 ve MOP-136894 (RB'ye) ve Canadian Foundation for Innovation Grant 950-225005 tarafından finanse edildi.
Materials
| Solutions | |||
| Barth's solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 90mM |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | 3mM |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-9397 | 0.82mM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C-7902 | 0.41mM |
| Ca(NO3)2 | Sigma-Aldrich | C-1396 | 0.33mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5mM |
| NaOH hydrate | BDH | BDH7225-4 | pH 7.6 |
| Penicilin | Invitrogen | 15140122 | 100U/mL |
| Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | 100µg/mL |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160054 | 10mg/100mL |
| Horse serum | Invitrogen | 16050122 | 5% |
| SOS Standard Oocyte Solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | 102 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | 3 mM |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | 1 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| External recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Internal recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Labeling solution | |||
| KOH | Fisher Scientific | P250-1 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| TMR stock solution | |||
| Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR) | Molcular Probes by Life Technologies | T6027 | 5mM in DMSO |
| Anap stock solution | |||
| Anap | ABZENA (TCRS) | Custom synthesis TCRS-170 | 1mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1N |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| pAnap | Addgene | 48696 | |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan Corporation | CA-1B | |
| Gpatch Acquisition software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Analysis software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Recording Chamber | Custom machined | ||
| Photo diode detection system | Dagan Corporation | PhotoMax-200/PIN | |
| Electrical shutter driver | UNIBLITZ | VCM-D1 | |
Referenzen
- Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).
- Xiao, H., Schultz, P. G. At the Interface of Chemical and Biological Synthesis: An Expanded Genetic Code. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (9), (2016).
- Blunck, R. Chapter 9. Handbook of Ion Channels. , 113-133 (2015).
- Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
- DeBerg, H. A., Brzovic, P. S., Flynn, G. E., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structure and Energetics of Allosteric Regulation of HCN2 Ion Channels by Cyclic Nucleotides. J Biol Chem. 291 (1), 371-381 (2016).
- Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
- Aman, T. K., Gordon, S. E., Zagotta, W. N. Regulation of CNGA1 Channel Gating by Interactions with the Membrane. J Biol Chem. 291 (19), 9939-9947 (2016).
- Haddad, G. A., Blunck, R. Mode shift of the voltage sensors in Shaker K+ channels is caused by energetic coupling to the pore domain. J Gen Physiol. 137 (5), 455-472 (2011).
- Batulan, Z., Haddad, G. A., Blunck, R. An intersubunit interaction between S4-S5 linker and S6 is responsible for the slow off-gating component in Shaker K+ channels. J Biol Chem. 285 (18), 14005-14019 (2010).
- Kusch, J., et al. How subunits cooperate in cAMP-induced activation of homotetrameric HCN2 channels. Nat Chem Biol. 8 (2), 162-169 (2012).
- Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
- Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Reinitiation at non-canonical start codons leads to leak expression when incorporating unnatural amino acids. Sci Rep. 5, 11866 (2015).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).
- Beckert, B., Masquida, B. Synthesis of RNA by in vitro transcription. Methods Mol Biol. 703, 29-41 (2011).
- Goldin, A. L. Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection. Methods Enzymol. 207, 266-279 (1992).
- Rudokas, M. W., Varga, Z., Schubert, A. R., Asaro, A. B., Silva, J. R. The Xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Zhao, J., Blunck, R. The isolated voltage sensing domain of the Shaker potassium channel forms a voltage-gated cation channel. Elife. 5, (2016).
- Posson, D. J., Ge, P., Miller, C., Bezanilla, F., Selvin, P. R. Small vertical movement of a K+ channel voltage sensor measured with luminescence energy transfer. Nature. 436 (7052), 848-851 (2005).
- Chanda, B., Asamoah, O. K., Blunck, R., Roux, B., Bezanilla, F. Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement. Nature. 436 (7052), 852-856 (2005).
- Taraska, J. W., Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Short-distance probes for protein backbone structure based on energy transfer between bimane and transition metal ions. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16227-16232 (2009).
- Baker, B. J., et al. Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 53-67 (2008).
- Miranda, P., et al. State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T. Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids. Methods. 36 (3), 270-278 (2005).
- Hohsaka, T., Ashizuka, Y., Murakami, H., Sisido, M. Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins. Nucleic Acids Res. 29 (17), 3646-3651 (2001).
