Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.
The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis.
Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories.
This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.
ウマヘルペスウイルス2型(EHV-2)は、このような鼻汁、咽頭炎やリンパ節の腫れ1-3のような潜在的な臨床症状で、呼吸器症候群に関与しています。このウイルスはまた、馬産業の2のための重要なと負の経済的影響をもたらす可能性がある、馬の貧弱なパフォーマンスとの関連が疑われています。
今までは、ガンマ – EHVのゴールドスタンダード(γ-EHV)の検出は、細胞培養方法でした。この手順の最初の不便さは、EHV-2およびその他のγ-EHVの( 例えば、EHV-5)との間に差別が存在しないことでした。第二の不便は4,5をマニフェストに12〜28日からかかる細胞変性プロセスの遅い開発でした。
検証および正規化された定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の開発(QRT-PCR)は、この方法は、迅速にEHV-2とEHV-区別するために、ウイルスを検出するために役立ちます5およびウイルスゲノムの負荷と定量化の側面に病気のおかげとの関係を研究します。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)マリス6によって1986年に初めて記載され、生物学的診断(人間、環境と獣医学)の分野のほとんどに新しいゴールドスタンダードになろうとしているれました。特異性、感度、迅速性:病原体のゲノムの一部の増幅に基づいている。この方法は、多くの利点を提供します。また、アンプリコン混入のリスクを定量RT-PCRの出現及び品質保証7が後退しました。それにもかかわらず、新たなゴールドスタンダード法としてPCRの認識がちょうど改善されたパフォーマンスデータだけでなく、時間をかけて性能の劣化なしに全体の方法の開発と検証段階の制御の実証以上を必要としました。
EHV-2の検出のために使用される最初の分子ツールは、時間Cでしたonsumingおよびシーケンシング8に続いて、ネストされたPCRに関わる非特異的な増幅。ヘルペスウイルスの標的遺伝子は、デオキシリボ核酸(DNA)ポリメラーゼとDNAパッケージ9でした。ただし、ネストされたPCRアンプリコンによる汚染の高いリスクを提示します。それ以来、従来のPCR試験は、最近になって、リアルタイムPCRの特性はEHV-2 10の定量のために記載した。2009年に概説インターロイキン10様遺伝子または糖タンパク質B遺伝子を増幅するために設計されたが、データは利用できなかったされてい抽出プロセスを含む全方法の検証について。
このプロトコルでは、開発と検証の手順は協会フランセーズデ正規化 (AFNOR)によると、馬の呼吸器流体中のEHV-2 DNAの検出および定量化のための定量的PCR法に記載されている標準NF U47-600 3,11,12、フランス代表ではあります国際標準化委員会。この規範は、NF EN ISO / CEI 17025、2005〜13及びOIE(国際獣疫事務局)によると、11,12「動物衛生分析法における獣医学PCRの実施、開発と検証のための要件と推奨事項」詳細勧告、2010年14 EHV-2のqRT-PCR検証プロトコルは、3部構成の手順が含まれます。定量RT-PCRアッセイの(a)の開発、(b)は、単独で定量RT-PCRアッセイの特徴付けおよび全体の(c)の特性評価(PCR分析の生体試料からの核酸の抽出から)分析方法。
検出(LOD)の限界と定量限界(LOQ):定量RT-PCRアッセイの全体分析方法の特徴は、二つの限界の定義が含まれています。 LOD 95%PCRは、すべてのCAの95%で検出することができ、単位体積当たりの核酸コピーの最小数を表しますエス。 LOQ 95%PCRを考慮に不確実性を取ることを決定することができる核酸コピーの最小量を表します。
この定量RT-PCR法は、呼吸流体中の正確な検出およびEHV-2の迅速な定量化を可能にします。さらに、この方法は、他の新たな定量RT-PCRアッセイの開発のための標準化された手順とのような一般的なテンプレートを確実にするために、他の研究室に適用することができます。
2000年代以来、リアルタイムPCRは、研究室の数の増加に金の標準的な技術(細胞培養および細菌培養法)に代わるされています。技術の実装は比較的容易です。しかし、実験室方法の検証は、正確で再現性と信頼性の高いデータを確実にするために、病原体の分子検出および定量化のために不可欠です。
抽出工程は、生物学的材料の損失の主要な源であるので、あるプロトコルから別の定量化の誤差の主な原因と考えられてもよいです。このように、主に文献に報告された定量RT-PCR中のDNAプラスミドの標準曲線の作成は、ウイルスゲノムの負荷を示しているが、抽出工程を考慮していません。
AFNORノルムNF U47-600-2全体メソッドの検証プロセスのためのデノボ戦略の説明は、この分野における重要な進歩を表しています。に示すようにEHV-2ウマのため、この論文では、または蜂21で他の人が、これは現像工程および方法全体のPCRの特性評価および特性評価と検証ステップの間に明確な区別が必要となります。この興味深いアプローチで1つの制限は、プロトコルの変化は非常にコストがかかる可能性があり、完全なプロセスを再検証する義務をもたらすことがあります。この制限はまた、定量化の範囲は、ウイルス( 例えば、呼吸器流体、器官、血液又は尿)が抽出されたソースに依存するという事実によって強調されました。実際には、各マトリックスは、それらの物理化学的特性が異なる特異性を提示し、独立して定量RT-PCRによるウイルスの検出および定量のために使用される各異なる行列を定義することが重要です。従って、各生物学的試料のウイルスゲノムの負荷が抽出からより正確に定量することができます。特徴付けはまた、サーマルサイクラーのmodを考慮に入れますエルと以前よく特徴付けられた方法( 例えば、本論文で述べたEHV-2定量PCR法)の使用は、親の実験室や他の研究室でのマシンの新しいタイプを必要とするとき、人はその楽器の性能を確認する必要があります。定量PCRアッセイの性能の確認はすべてのテストが実験室に持ち込むための前提条件です。これは通常、既知の特性を有する参照試料を分析することによって達成されます。このようなチェックが前提条件と定量PCR(LOD、LOQ効率)の性能と全体の方法(LOD、LOQ)の堅牢性を検証するために、NF 47-600-1 AFNORノルムによって要求されるように必須と考えられています。開発と特徴付けステップの間だけでなく、研究または診断目的のために使用される場合、リスク要因は、プロトコルの標準化を確実にするために、同定され、十分に制御することができます。特に懸念されるのに十分なスタッフのトレーニング、優秀な人材、消耗品の品質管理です使用されており、そのストレージ、即時の環境条件およびアッセイに関わる科学機器の性能に影響を与える可能性が計量条件の意識のコントロール。試験所間比較のための参照サンプルの使用は、不確実性を制御するのに役立つ可能性があります。このようにして、研究室間でのデータの比較を容易にすることができます。実際、研究室間の実力テストが評価し、方法の再現性を確認するために必須です。
分析生体マトリックスの国際単位(IU)で表されているウイルスゲノムの負荷の結果は、(IUは:流体またはコピーのコピー/ ml組織について/ g)は、異なる研究室間の結果を比較するために使用するのが容易です。 LOQ上記の全ての結果は、非定量化陽性の結果としたコピー/ mlとLODとLOQの間の結果として発現されます。このように、ゲノムの量化データを提示することはプロセスへとより正確に準拠します分析(ゲノムの増幅)のS。実際には、細胞培養実験において、TCID 50によるウイルス量の式(50%組織培養感染用量) 細胞やウイルス株の性質に依存します。各菌株のラインは、その独特の感染動態を有し、最初の細胞変性効果が明らかである前に、EHV-2のようないくつかのウイルスは数日かかることがあります。
結論として、定量RT-PCRの特性のこの新しい方法は、研究所間のデータの提示および解釈の調和を促進すべきです。これは、疾患の状態の宣言の代わりに、単に病原体の有無についてのカットオフ値の確立など、将来の定量RT-PCRの潜在的な新しいアプリケーションのために非常に有用であろう。
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Sophie Castagnet and Nadia Doubli-Bounoua for their technical support. This work received financial support from the General Council of Calvados and the agreement of Region Basse-Normandie and French Government (CPER 2007-2013; project R25 p3). The authors would like to thank the experts of the AFNOR group and particularly Jean-Philippe Buffereau and Eric Dubois.
AB-1900 natural color ABgene 96 well plate | Dutsher | 16924 | |
Adhesive film QPCR Absolute | Dutsher | 16629 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
0.5 mL microtubes, skirted, caps | Dutsher | 039258 | |
Ethanol 98% | Sodipro | SAF322941000 | |
Primers | Eurofins | Custom order | |
Probe | Life Technologies | Custom order | |
Plasmid | Eurofins | Custom order | |
QIAamp RNA viral Mini Kit (containing: QIAamp Mini column, AVL buffer, AW1 buffer, AW2 buffer, AVE buffer, collection tubes) |
Qiagen | 52906 | AVL buffer: pre-warm 5 min at 72°C |
Sequencing by Sanger method | Eurofins | Custom order | |
Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4364340 | |
Tris-EDTA buffer solution | Santa Cruz | sc-296653A | |
NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermoscientific | ND-2000C | |
StepOnePlus Real-Time PCR systems | Life Technologies | 4376600 | pre-warm 15 min |