Sviluppo e validazione di un metodo quantitativo per PCR Equid herpesvirus-2 Diagnostica in respiratorie Fluidi

Nota: fare riferimento a tutte le varie fasi, che sono illustrati nella Figura 1. 1. Estrazione di acidi nucleici Nota: Eseguire l'estrazione sotto una cappa aspirante per limitare la contaminazione delle vie aeree con acidi nucleici. Includere un controllo negativo estrazione con acqua trattata con DEPC per garantire che nessuno dei reagenti sono contaminati con DNA indesiderato. Estratto acidi nucleici dal campione biologico secondo un protocollo protocollo 15 e produttore precedentemente descritto. Aggiungere 140 pl di campione biologico a 560 ml di soluzione di lisi (tampone AVL) e incubare per 10 min a temperatura ambiente. Aggiungere 560 ml di etanolo. Applicare i primi 630 ml di questa soluzione (campione + lisi soluzione + etanolo) ad una colonna di silice e centrifugare. Applicare i restanti 630 ml di questa soluzione alla stessa colonna di silice e centrifugare. Quindi lavare la colonna con 500 microlitridi 2 diversi tamponi di lavaggio (AW1 e Aw2). Eluire acido nucleico con 50 ml di tampone di eluizione (tampone AVE) ed equilibrare a temperatura ambiente. Chiudere il coperchio e incubare a temperatura ambiente per 1 min. Centrifugare a 6,000 g per 1 min. 2. Procedura di amplificazione Preparare 22,5 ml di mix di reazione per ogni reazione. Aggiungere 12,5 ml di PCR Master Mix, x ml di 20 micron di primer in avanti, x ml di 20 micron di primer inverso, y ml di sonda 10 micron e z ml di acqua ultrapura come richiesto per raggiungere 22,5 ml (x, i volumi Y e Z sono ottenuti dopo la titolazione, vedere le sezioni 3.2.3 e 3.2.6). Aliquotare 22,5 ml di miscela di reazione appropriata a ciascun pozzetto di reazione in una piastra da 96 pozzetti. Nota: includere controlli negativi per l'estrazione e per PCR per garantire che nessuno dei reagenti sono contaminati con DNA indesiderato. Aggiungere 2,5 ml di campione, 2,5 ml di estrazione negativcontrollo e, 2,5 ml di PCR controllo negativo e 2,5 ml di campione positivo (ceppo di riferimento o plasmide) al corrispondente pozzetto di reazione. Dopo la distribuzione, coprire la piastra con un sigillo piastra adesiva. Centrifugare la piastra per 10 secondi a 6.000 g. Porre la piastra in un sistema PCR Real-Time. Selezionare il modello per il layout del test e iniziare la corsa. Utilizzare l'impostazione del programma PCR: 10 min a 95 ° C seguiti da 45 cicli di 15 secondi a 95 ° C e 1 min a 60 ° C (Tabella 1). Trasferire i dati grezzi dal sistema PCR Real-Time di un foglio di calcolo. Impostare la soglia per i grafici di amplificazione sopra la linea di base e all'interno della regione di crescita esponenziale avere la ciclo soglia per ogni campione. Tracciare ogni standard set point come una curva standard per ottenere la linearità. Calcolare il numero di copie per i diversi campioni sulla base della curva standard. 3. Sviluppo di RT-PCR quantitativa Nota: Lo sviluppo di un test qRT-PCR richiede ceppi di riferimento, una specifica plasmide titolata, e diversi controlli e comporta la titolazione dei primer e della sonda. prova preliminare Primer design e sonde con software specifico in base alle raccomandazioni precedenti 16. Estrarre ceppi di riferimento come descritto nella sezione 1. Amplificare come descritto nella sezione 2 con 900 nM per la concentrazione finale di primer e 250 nM per la concentrazione finale di sonda. Analizzare il segnale come descritto nella sezione 2.5. Allo stesso tempo, eseguire amplificazione del DNA ceppi di riferimento (come descritto nella sezione 3.1.3) senza sonde. Sequenziare il ampliconi ottenuti con il metodo Sanger 17,18. Analizzare le sequenze eseguendo un BLAST nucleotide 19. Titolazione di primer e sonda Preparare 3 differenti miscele con 250 nM concentrazione finale di sonda e con diversi Conc finalezioni di avanti e indietro primer (50 Nm / 50 Nm, 300 Nm / 300 Nm, 900 Nm / 900 nm) per i 3 repliche del campione positivo e un controllo negativo. Per ogni miscela, aggiungere lo stesso volume appropriato di 20 pM forward primer e 20 pM primer reverse (0,25 ml per ottenere la concentrazione finale di 50 nM, 1,5 ml per ottenere i 300 nM concentrazione finale o 4,5 ml per ottenere la concentrazione finale di 900 nM) , 50 ml di PCR Master mix, 2,5 ml di sonda 10 micron e acqua ultrapura come richiesto per raggiungere i 90 ml. Eseguire la procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Scegliere la migliore condizione per ottenere il massimo livello di amplificazione, soglia primo ciclo (Ct) e migliore ripetibilità tra le 3 condizioni. Determinare la migliore concentrazione ed il corrispondente volume di x ml di primer in avanti e retromarcia. Preparare 5 miscele diverse per i 4 campioni (3 repliche del campione positivo e un controllo negativo)con 5 diverse concentrazioni finali di sonda (50 nm, e 100 nm, 150 Nm, 200 Nm, 250 Nm). Per ogni miscela, aggiungere x ml di 20 micron di primer in avanti e x ml di 20 mM primer reverse (precedentemente determinato, al punto 3.2.3), 50 ml di PCR Master Mix, il volume appropriato di 10 micron sonda (0,5 ml per ottenere il 50 concentrazione nM, 1 ml per ottenere la concentrazione di 100 nM, 1,5 microlitri per ottenere la concentrazione 150 nM, 2 microlitri per ottenere la concentrazione 200 nM o 2,5 microlitri avere la 250 concentrazione nM) e acqua ultrapura come richiesto per raggiungere i 90 microlitri. Eseguire la procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Scegliere la migliore condizione per ottenere il massimo livello di amplificazione, soglia primo ciclo (Ct) e migliore ripetibilità tra le 5 condizioni. Determinare la migliore concentrazione e il volume corrispondente y microlitri per la sonda. 4. Caratterizzazione di Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) Nota: Dopo la fase di sviluppo e la determinazione delle migliori condizioni di utilizzare, il passo caratterizzazione della PCR comprende la specificità, il limite di rilevazione, la gamma di linearità e il limite di quantificazione di qRT-PCR. Preparazione e titolazione di plasmidi Ordine plasmide commerciale contenente il relativo frammento del gene target DNA scelto per la PCR (in questo protocollo, i nucleotidi 2081-2381 di EHV-2 gene della glicoproteina B, vedi tabella 1). Nota: Per limitare il rischio di contaminazione delle vie aeree con DNA sintetico, eseguire diluizioni seriali di plasmidi sotto una cappa in una camera separata e lavorare con DNA diluito durante tutte le fasi di sviluppo e procedura di convalida. Risospendere il plasmide con acqua ultrapura per preparare una soluzione madre a 50 ng / ml. Vortex e centrifugare brevemente la soluzione plasmide magazzino. Nota: Determinare la vera concentrazione della STO plasmidesoluzione ck dopo risospensione al fine di calcolare il numero di copie del plasmide. Aggiungere 1 ml di plasmide allo spettrofotometro. Leggere la densità ottica (OD) a 230 nm, 260 nm e 280 nm. Leggere la concentrazione di DNA sul software spettrofotometro (OD, 260 nm). Calcolare il numero di copie del plasmide utilizzando il numero di Avogadro (N A) e la formula: Numero di copie / ml = (N A [plasmide in ng / ml]) / (lunghezza plasmide x 10 9 x peso medio di una coppia di basi) = (6.022 x 10 23 x [plasmide]) / (lunghezza plasmide x 10 9 x 660) Test del Specificità (inclusività ed esclusività) di qRT-PCR Testare l'inclusività del sistema PCR. Selezionare EHV-2 campioni di DNA positivi, precedentemente caratterizzata da sequenziamento (stabilito lo stato positivo). Eseguire la procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. analizzare ladati PCR per ciascun campione, come descritto nella sezione 2.5. Controllare la presenza di una curva esponenziale per tutti i campioni prelevati al punto 4.2.1 e confermare inclusione di PCR. Testare l'esclusività del sistema PCR utilizzando estratti di DNA da agenti patogeni con somiglianze genetiche al bersaglio (in questo caso, altri herpesvirus equide, come EHV-1, EHV-4, EHV-3, EHV-5 e asinino herpesvirus-5 come descritto nella tabella 2) e altri agenti patogeni coinvolti nelle malattie respiratorie dell'ospite (in questo caso, il virus arterite equina, il virus dell'influenza equina, Coxiella burnetii, Rhodococcus equi, Streptococcus equi equi, Streptococcus equi zooepidemicus, Chlamydophila abortus e Klebsiella pneumoniae, vedi tabella 2). Eseguire la procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Analizzare i dati PCR per ogni campione come descritto nella sezione 2.5. Controllare l'assenza di una curva esponenziale per tutti i campioni sceltisezione 4.2.4 per confermare l'esclusività della PCR. Limite di Rilevazione di qRT-PCR Dispensare 90 ml di acqua ultrapura in 6 tubi. Eseguire 6 diluizioni seriali dieci volte del plasmide di indirizzare la zona di abbattimento (perdita di rilevazione Ct). Trasferimento 10 microlitri dal plasmide diluizione di lavoro al tubo con 90 ml di acqua ultrapura. Vortex e centrifugare brevemente la provetta. Ripetere il punto 4.3.2 fino all'ultimo tubo nella diluizione in serie ha ricevuto il plasmide. Eseguire l'amplificazione delle 6 diluizioni seriali dieci volte del plasmide come descritto nella sezione 2. Determinare la zona di abbattimento: la zona tra l'ultima diluizione del plasmide è presente un segnale positivo e la prima diluizione senza rilevamento (vedere la Figura 2). Per avviare i 6 diluizioni seriali di due-fold, scegliere l'ultima diluizione del plasmide che dà un segnale positivo (vedi paragrafo 4.3.4). Nota: Eseguire 3 tri indipendenteals per determinare il limite di rilevazione di qRT-PCR (LOD 95% PCR) Dispensare 25 ml di acqua ultrapura in 6 tubi. Eseguire 6 diluizioni seriali duplici del plasmide. Trasferimento 25 microlitri dalla diluizione di lavoro plasmide, determinato al punto 4.3.5, al tubo con 25 ml di acqua ultrapura. Vortex e centrifugare brevemente la provetta. Ripetere il punto 4.3.7 fino all'ultimo tubo nella diluizione in serie ha ricevuto il plasmide. Eseguire l'amplificazione delle 6 diluizioni seriali duplici del plasmide come descritto nella sezione 2. Ripetere i punti 4.3.7 a 4.3.8 per due volte, per ottenere 3 prove con 8 repliche (24 replicati) di ciascuno dei 6 dieci volte diluizioni seriali del plasmide. Nota: Il limite di rilevazione di qRT-PCR (LOD 95% PCR) è definito come il numero più basso copie di DNA per unità di volume che viene rilevato nel 95% dei casi. Calcolare il numero di repliche positive di 24 replicati per ogni livello di concentrazione plasmidezione. Determinare il LOD 95% PCR. Il LOD 95% PCR è il livello che comporta la rilevazione di 23 replicati positivi su 24 replicati. Gamma di linearità e limite di quantificazione dei qRT-PCR Nota: eseguire 4 prove indipendenti con 6 diluizioni seriali dieci volte del plasmide per assicurare che la concentrazione minima utilizzata nell'intervallo corrispondente al LOD 95% PCR determinato in precedenza in 4.3.10. Dispensare 45 ml di acqua ultrapura a 6 tubi. Avviare i 6 diluizioni seriali dieci volte con la concentrazione di plasmide diluizione di lavoro corrispondente a 10 7 LOD 95% PCR. Eseguire 6 diluizioni seriali dieci volte del plasmide. Transfer 5 microlitri dalla diluizione di lavoro plasmide (determinato al punto 4.4.2) nella provetta con 45 ml di acqua ultrapura. Vortex e centrifugare brevemente la provetta. Ripetere il punto 4.4.3 fino all'ultimo tubo nella diluizione in serie ha ricevuto plasmid. Amplificare i 6 diluizioni seriali dieci volte del plasmide come descritto nella sezione 2. Tracciare la regressione lineare y = ax + b con per la pendenza e b per l'intercetta (Figura 3). Calcolare l'efficienza di amplificazione (E) dalla pendenza di una curva standard (vedi 4.4.5) utilizzando l'equazione: . Ripetere i punti 4.4.1 a 4.4.6 tre volte. Nota: efficienza di amplificazione rappresenta la quantità di aumento prodotto di PCR dopo ogni ciclo. Una reazione ideale raggiunge efficienza vicino al 100%. In pratica, E (%) è tra il 75% e il 125%. Superiore E può indicare l'amplificazione di prodotti non specifici o un errore di pipettamento nella diluizione seriale. Lower E può anche indicare un errore di pipettamento nella diluizione in serie, cattiva progettazione primer o condizioni di reazione non ottimali. Calcolare il bias (Tabella3). Verificare per ogni livello plasmide che il valore di polarizzazione assoluto è inferiore al valore di polarizzazione critica (0,25 log 10). Determinare la polarizzazione media e le incertezze di linearità (U Lini) per ogni livello plasmide (Tabella 3) per valutare le prestazioni di regressione lineare per EHV-2 qPCR (Figura 4). U Lini è l'incertezza linearità determinata per ogni i plasmide livello calcolato da deviazione standard (SD'i) e media bias. Determinare l'incertezza linearità combinata (U LIN) di EHV-2 qPCR dato dalla formula: Nota: L'accettazione di bias è specificato dal laboratorio (in generale pregiudizi assoluto 0,25 log 10) e corrisponde alla differenza tra il valore più basso e il valore più alto di 0,5 log 10 (quantità misurata in log 10 numero di copie). U LIN </sub> valore potrebbe aiutare a confrontare le prestazioni di qPCR da diversi laboratori. Determinare il limite di quantificazione del qRT-PCR (LOQ PCR): LOQ PCR è la più bassa concentrazione con una polarizzazione 0,25 log 10 usato per il campo di linearità (Tabella 3). 5. Caratterizzazione del metodo analitico totale (da DNA Extraction al risultato qRT-PCR) Nota: La caratterizzazione di tutto il metodo è la convalida di tutti i passi necessari per ottenere dati qRT-PCR (vale a dire, dalla estrazione del DNA dal campione respiratoria (vedere paragrafo 1) per l'amplificazione e quantificazione del target (vedere la sezione 2 )). Stabilire corrispondenza tra il numero di copie nella reazione PCR e il numero di copie presenti nel campione biologico con la formula: . Il <img alt="5.1-2" src="/files/ftp_upload/53672/5.1-2.jpg" /> È il numero di copie del plasmide nella reazione PCR, è il volume del campione aggiunto alla miscela PCR per l'amplificazione, è il volume di tampone AVE usato per eluire gli acidi nucleici e è il volume del campione estratto. Testare la sensibilità e specificità del metodo analitico intero Nota: Solo note positive (o negative) campioni EHV-2 sono utilizzati in questa sezione. Testare la "sensibilità" del metodo qRT-PCR analizzando campioni positivi per il target (EHV-2). Selezionare EHV-2 campioni di DNA positivi, precedentemente caratterizzato (stato positivo). Estrarre l'acido nucleico come descritto nella sezione 1. Eseguire una procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Determinare il numero di positivi reali (campioni positiviche sono positive con questo RT-PCR) e il numero di falsi negativi (noto campioni positivi che sono negativi con questa RT-PCR). Testare il "specificità" del metodo qRT-PCR analizzando campioni negativi Selezionare EHV-2 campioni di DNA negativi (stato negativo). Estrarre l'acido nucleico come descritto nella sezione 1. Eseguire una procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Determinare il numero di negativi reali (campioni negativi che sono noti per essere negativa con questo RT-PCR) e il numero di falsi positivi (noti campioni negativi che sono positivi con questo RT-PCR). Calcolare il "sensibilità diagnostica" (Se) e "specificità diagnostica" (Sp) di tutto il metodo (tabella 4) come segue: Se = numero di positivi reali / (numero di veri positivi + falsi negativi) e Sp = numero di reale negativi / (numero di reale negativos + falsi positivi) (vedi tabella 4). Calcola l'intervallo di confidenza del 95% per la sensibilità e la specificità del tutto il metodo con la formula del Greiner e Gardner relazione 12,20: dove e è l'errore previsto, θ è il Se (o Sp) ed n il numero di campioni analizzati. Nota: Per un piccolo numero di campioni, utilizzare la tabella Schwartz secondo AFNOR norma 12 per calcolare l'intervallo di confidenza del 95% per la sensibilità e la specificità di tutta metodo. Preparazione di negativo risorsa materiale per la caratterizzazione del metodo analitico intero ATTENZIONE: per determinare i limiti di rilevazione e quantificazione del tutto il metodo (LOD metodo e il metodo LOQ), aggiungere concentrazioni note di plasmide per i campioni biologici che sono noti per essere liberidel target (EHV-2 in questo caso). Questi campioni, insieme con il plasmide quantificato, costituiscono norme positive con cui determinare il metodo LOD e il metodo LOQ. Confermare l'assenza di destinazione (EHV-2) nei campioni biologici utilizzati per la costruzione di norme positive. Scegliere diversi campioni biologici negativi noti. Estrarre campioni biologici come descritto nel paragrafo 1. Eseguire la procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Confermare l'assenza di bersaglio di assenza del segnale di PCR in questi campioni. Nota: utilizzare lo stesso materiale risorsa negativa per tutti i passaggi tra 5.4 e 5.5. Pool diversi campioni negativi per ottenere 15 ml di materiale risorsa negativa (un volume necessario per la convalida completa). Dispensare 135 ml di questo materiale risorsa negativa in 100 provette. Mantenere provette a + 4 ° C oa -80 ° C per lunga conservazione. Limit di rilevazione del metodo analitico intero Determinare la zona di abbattimento dell'intero metodo. Dispensare 45 ml di acqua ultrapura a 6 tubi. Eseguire 6 diluizioni seriali dieci volte del plasmide. Transfer 5 microlitri dalla diluizione di lavoro plasmide corrispondente a 10 7 LOD 95% PCR (come determinato al punto 4.3.10) al tubo con 45 ml di acqua ultrapura. Vortex e centrifugare brevemente la provetta. Ripetere il punto 5.4.1.2 fino all'ultimo tubo nella diluizione in serie ha ricevuto plasmide. Trasferire 5 ml di ogni diluizione del plasmide a 2 tubi con 135 ml di materiale risorsa negativa per ottenere 2 replica per le 6 norme positive. Vortex e centrifugare brevemente. Eseguire l'estrazione dei 2 repliche per le 6 norme positive, come descritto nella sezione 1. Eseguire la procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Determinare la zona di abbattimento: la zona tra l'ultimo concentration di plasmide dare un segnale positivo e la prima concentrazione che mostra alcun segnale. Limite di rilevazione del metodo (LOD Method) determinato da 2 prove indipendenti Nota: Eseguire 2 studi indipendenti per determinare il limite di rilevazione del tutto il metodo (LOD Method). Avviare i 6 diluizioni seriali a due-fold con la diluizione di lavoro plasmide che è 4 volte più concentrato che l'ultima concentrazione del plasmide che ha dato un segnale positivo (vedi paragrafo 5.4.1.5). Dispensare 25 ml di acqua ultrapura a 6 tubi. Eseguire 5 diluizioni seriali duplici del plasmide. Trasferimento 25 microlitri dalla diluizione plasmide di lavoro (determinato al punto 5.4.2.1) alla provetta con 25 ml di acqua ultrapura. Vortex e centrifugare brevemente la provetta. Ripetere il punto 5.4.2.3 fino all'ultimo tubo nella diluizione in serie ha ricevuto plasmide. Trasferire 5 ml di ogni diluizione dei Plasmid a 4 tubi con 135 ml di materiale risorsa negativa per ottenere 4 repliche dei 5 standard positivi. Vortex e centrifugare brevemente i tubi. Eseguire l'estrazione delle 4 repliche per le 5 norme positive, come descritto nella sezione 1. Eseguire la procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Ripetere i punti 5.4.2.1 a 5.4.2.5, una volta per ottenere 8 repliche per ogni livello di concentrazione plasmide. Contare il numero di repliche positive su 8 repliche per ogni livello di concentrazione plasmide. Determinare il metodo LOD. Il metodo LOD è l'ultimo livello a cui 8 repliche su 8 repliche sono positivi (come descritto nella sezione 5.4.2.7). Gamma di linearità e limite di quantificazione del metodo analitico intero Nota: per determinare il limite di quantificazione di tutto il metodo di (LOQ Method), aggiungere concentrazioni note del plasmide al biologicocampioni che sono noti per essere liberi del target (EHV-2 in questo caso). Questi campioni costituiscono norme positivi per determinare il metodo LOQ. Dispensare 45 ml di acqua ultrapura a 6 tubi. Eseguire 6 diluizioni seriali dieci volte del plasmide. Transfer 5 microlitri dalla diluizione di lavoro plasmide corrispondente a 10 7 Metodo LOD (come determinato nella sezione 5.4.2.8) al tubo con 45 ml di acqua ultrapura. Vortex e centrifugare brevemente la provetta. Ripetere il punto 5.5.2 fino all'ultimo tubo nella diluizione in serie ha ricevuto il plasmide. Trasferire 5 ml di ogni diluizione del plasmide a 2 tubi con 135 ml di materiale risorsa biologica negativo per ottenere 2 repliche delle 6 norme positive. Vortex e centrifugare brevemente. Eseguire l'estrazione dei 2 repliche per le 6 norme positive, come descritto nella sezione 1. Eseguire la procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Ripetere i punti 5.5.1a 5.5.4 tre volte. Definire un profilo di precisione al fine di valutare e convalidare le prestazioni quantitativa del metodo. Definire i limiti di accettabilità di tutto il metodo per il laboratorio. In questo protocollo, i limiti di accettabilità sono definiti come ± 0,75 log 10 dal Labeo Frank Duncombe. Per una prova, tracciare un primo regressione lineare y = ax + b (a è l'inclinazione e b è l'intercetta) con una replica dei valori Ct corrispondente a ciascun valore stimato della curva standard. Con questo primo regressione lineare, calcolare il valore sperimentale del numero di copie per i replicati di valori Ct utilizzati per questa prima curva standard. Ripetere passaggio 5.5.5.2 con le seconde replicati di valori Ct per ottenere una seconda regressione lineare e calcolare il valore sperimentale del numero di copie per il secondo replicati di valori Ct utilizzati per la seconda curva standard. <li> Ripetere il passaggio 5.5.5.2 con la seconda e terza prova. Calcolare i limiti di precisione, esattezza e precisione per ogni livello plasmide secondo il NF U47-600-2 12. Creare un foglio di calcolo per compilare le informazioni per tutti i punti standard (5.5.5.4) e creare un profilo di precisione con i limiti di accettabilità precedentemente definite in 5.5.5.1 e la veridicità dei dati con il più basso e il limite di accuratezza superiori calcolato in 5.5 .5.4 (Figura 5). Determinare il metodo LOQ: ciò corrisponde alla più bassa concentrazione di una curva standard con esattezza 0,75 log 10 ed usati per il campo di linearità calcolata in 5.5.5.5. La valutazione di ripetibilità e riproducibilità Nota: Controllare la ripetibilità e riproducibilità utilizzando il rapporto tra la deviazione standard e la media delle misurazioni ripetute (coefficiente di variazione o CV = deviazione standard /significare). Valutare la ripetibilità del metodo insieme con 1 Analista: Scegli 3 campioni biologici con 3 distinti carichi genoma virale (precedentemente testato in PCR, per esempio). Estrarre 8 repliche dei 3 campioni come descritto nel paragrafo 1. Eseguire la procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Calcolare la media e la deviazione standard del valore Ct raccolto per ciascun campione. Calcolare il CV intra-saggio con la formula CV = deviazione standard / media. Valutare la riproducibilità del metodo intero da 3 Analisti: Scegli 3 campioni biologici con 3 distinti carichi genoma virale (precedentemente testato in PCR per esempio) Estrarre 2 replicati di 3 campioni scelti a 5.6.2.1 (come descritto nella sezione 1). Eseguire la procedura di amplificazione come descritto nella sezione 2. Ripetere i passaggi da 2 5.6.2.2 analisti indipendenti. Calcolare la media e la deviazione standarddel valore Ct raccolto per ciascun campione. Calcolare il CV inter-saggio con la formula CV = deviazione standard / media.