为马科动物疱疹病毒2诊断的呼吸道液体定量PCR检测方法的开发和验证

注意：参考所有在图1所示的不同的步骤。 1.核酸的提取注意：在通风橱下执行抽取，以限制与核酸气道受到污染。包括用DEPC处理过的水抽出的阴性对照，以确保没有试剂的被污染的不必要的DNA。 根据先前描述的方案15和制造商的方案从生物样品中提取核酸。 添加140微升生物样品的560微升裂解缓冲液（AVL缓冲液）孵育在室温下10分钟。添加560微升乙醇。施加第一630微升该溶液（样品+裂解液+乙醇）至硅胶柱和离心机。 申请的其余630微升该溶液以相同的二氧化硅柱和离心机。然后用500μl冲洗柱子2个不同的洗涤液（AW1和AW2）。 洗脱核酸用50μl洗脱缓冲液（AVE​​缓冲液），并平衡至室温。关闭盖并在室温下孵育1分钟。离心在6000克1分钟。 2.扩增程序准备22.5微升反应混合物的每个反应。添加12.5微升PCR主混合物，×20μM正向引物的微升，20μM反向引物，以达到22.5微升需要10μM探头和zÿ微升微升超纯水的X-微升（X，得到y和z卷滴定后，见第3.2.3和3.2.6）。 等分试样22.5微升合适的反应混合物到井在96孔板的每个反应的。 注：包括萃取阴性对照和进行PCR，以确保没有试剂的被污染的不必要的DNA。 添加2.5微升样品，2.5微升提取是负面的e控制，PCR阴性对照的2.5微升和2.5微升阳性样品（参考株或质粒）到相应的反应井。分配后，盖上粘性板密封板。在6000克离心10秒的板。 放置板实时PCR系统。选择试验布局模板，并开始运行。使用PCR程序设置：在95℃在95℃10分钟，随后15秒的45个循环，在60℃（ 表1）1分钟。 从实时PCR系统传输的原始数据到电子表格。设置阈值中的扩增曲线的基线的上方和指数增长区域内，以获得每个样品的阈值循环。绘制各点的标准设定为标准曲线，以获得线性。计算用于基于标准曲线上的不同样品的拷贝数。 3.定量RT-PCR的研制注：定量RT-PCR试验的发展需要参考株，具体的滴定质粒，以及不同的控制，并引起该引物和探针的滴定。 初步测试设计引物和探针与根据先前的建议16专用软件。 提取参考菌株如第1节。 与900纳米为引物的终浓度为250纳米探针的终浓度在第2描述的扩增。如第2.5节所述分析信号。 与此同时，执行标准菌株DNA扩增没有探针（如3.1.3节所述）。测序通过Sanger法17,18中得到的扩增子。通过运行核苷酸BLAST 19分析序列。 引物和探针的滴定制备3种不同的混合物与探针250 1nM终浓度和不同的最终精矿正向的ations和用于阳性样本和阴性对照的3次重复反向引物（50纳米/ 50纳米，300纳米/ 300纳米，900纳米/ 900纳米）。对于每一个组合，添加20μM的正向引物相同的适当体积和20μM的反向引物（0.25微升，得到50nM的最终浓度，1.5微升，得到300nM的终浓度或4.5微升，得到900 1nM终浓度） 50微升PCR主混合物，2.5微升10μM的探针和超纯水的要求达到90微升。 在第2节进行放大操作。 选择最好的条件来获得放大的最高水平，最早的循环阈值（CT）和3个条件之间最好的可重复性。确定最佳浓度和相应的数量×微升正向和反向引物。 准备4个样品5不同混合（阳性样品的3个重复和阴性对照）带探头的5种不同终浓度（50纳米，100纳米，150纳米，200纳米，250纳米）。对于每一个组合，添加X微升20μM正向引物和X微升20μM反向引物（先前确定的，在3.2.3节），50微升PCR扩增预混，10μM探头适当的体积（0.5μl到获得50nM的浓度，将1μl得到的100nM的浓度，1.5微升，得到为150nM浓度，2微升获得200nM的浓度或2.5微升，得到250纳米浓度）和超纯水的要求达到90微升。 在第2节进行放大操作。 选择最佳的条件，以获得扩增的最高水平，最早循环阈值（CT）和5条件之间最佳重复性。确定最佳的浓度和相应的音量Ÿ微升的探头。 4.定量表征的雷阿L-time PCR检测（定量RT-PCR） 注意：最佳条件的显影步骤和判定使用后，在PCR的表征步骤包括的特异性，检测限，线性范围和定量RT-PCR的定量限。 制备及质粒的滴定订购包含选择用于PCR DNA靶基因的相关片段的商业质粒（在这个协议中，核苷酸EHV-2糖蛋白B基因的2081年至2381年， 见表1）。 注意：为了限制与合成DNA气污染的风险，在一个单独的房间中的开发和验证过程的所有步骤在通风橱下执行的质粒的系列稀释，用稀的DNA的工作。 重悬用超纯水该质粒在50纳克/毫升制备贮备液。涡短暂离心质粒原液。 注：确定质粒STO的实际浓度为了计算该质粒的拷贝数重新悬浮后放溶液。 加入1μl质粒的分光光度计。读在230nm，260 nm和280nm处的光密度（OD）。读出的分光光度计软件（OD，260纳米）的DNA浓度。 计算使用阿伏伽德罗数（N A）和式质粒的拷贝数： 拷贝数/微升=（N A [以ng质粒/微升）/（质粒长×10 9×平均体重碱基对）=（6022×10 23 X [质粒]）/（质粒长×10 9× 660） 测试定量RT-PCR的特异性（包容性和排他性） 测试PCR系统的包容性。选择超高压-2阳性的DNA样本，以前的特点测序​​（建立积极的状态）。 在第2节进行放大操作。 分析如在2.5节所述对每个样品PCR数据。检查第4.2.1节中选择所有样本的指数曲线的存在，并确认PCR的包容性。 测试使用DNA提取物与遗传相似性病原体至目标的PCR体系的排他性（在此情况下，作为所述的其它马科动物疱疹病毒如EHV-1，EHV-4，EHV-3，EHV-5和愚蠢疱疹病毒5在表2中）和涉及在宿主的呼吸系统疾病的其他病原体（在这种情况下，马动脉炎病毒，马流感病毒， 贝氏柯克斯体，马红球菌，链球菌球菌 ， 链球菌兽疫，衣原体流产和肺炎克雷伯菌 ， 见表2）。 在第2节进行放大操作。 如在第2.5节中所述分析每个样品的PCR数据。检查没有指数曲线的所有样品中选择第4.2.4确认PCR的排他性。 定量RT-PCR的检测限分配90微升的超纯水为6管。 执行质粒6十倍系列稀释为目标的消减区数（Ct检测损失）。转移10微升来自质粒工作稀释到管90微升超纯水。涡短暂离心管。重复步骤4.3.2直到在连续稀释的最后管已接收到质粒。 如在第2描述的执行该质粒的6十倍系列稀释的扩增。 确定消减区：质粒的最后稀释呈现阳性信号和第一稀释而不检测之间的区域（参见图2）。 要启动6两倍连续稀释，选择质粒的最后稀释度给出了阳性信号（参见4.3.4）。 注：执行3个独立的三ALS确定检测定量RT-PCR（LOD 95％PCR）的极限分配25μl的超纯水为6管。 执行质粒6的两倍连续稀释。转自质粒工作液25微升，如第4.3.5确定，在管与25微升超纯水。涡短暂离心管。重复步骤4.3.7直到在连续稀释的最后管已接收到质粒。 如在部分所述进行质粒的6两倍连续稀释的扩增2.重复步骤4.3.7至4.3.8两次，得到3试验与每个6十倍的8次重复（24次重复）质粒的系列稀释液。 注意：检测定量RT-PCR检测限（LOD 95％的PCR）的极限被定义为在95％的病例检测体积单元的最低DNA拷贝数。 计算阳性重复数出24个重复质粒concentra每一级化。 确定LOD 95％PCR。检测限的95％的PCR是其导致在检测的23阳性重复出24次重复的水平。 线性范围和定量RT-PCR方法定量限注意：用质粒的6十倍系列稀释液进行4个独立的试验，以保证在范围使用的最低浓度对应于检测限的95％的PCR在4.3.10预先确定。 分配45微升的超纯水在6管。 开始用质粒工作稀释的相当于10 7的LOD 95％的PCR浓度6十倍系列稀释。 执行质粒6十倍系列稀释。传递来自质粒工作稀释度（在第4.4.2节确定的）与45微升的超纯水的管5微升。涡短暂离心管。在连续稀释重复步骤4.4.3，直到最后管已接收到的Plasmid。 如在第2描述的扩增质粒的6十倍系列稀释。 迹线性回归Y = AX + B，其中A为斜率和b为截距（ 图3）。 计算从标准曲线的斜率的扩增效率（E）的使用方程（参见4.4.5）： 。 重复步骤4.4.1至4.4.6三次。 注意：扩增效率表示的每个周期后PCR产物的增加量。一种理想的反应达到效率接近100％。在实践中，E（％）为75％和125％之间。更高E可表示的非特异性产物，或在连续稀释移液误差放大。较低的E也能表明，在连续稀释，可怜的引物设计和非最佳反应条件移液错误。 计算偏差（ 表3）。验证每个质粒级别的绝对偏差值小于临界偏压值（0.25日志10）。确定平均偏差和线性的不确定性（U 的LiNi）对于每种质粒水平（ 见表3）以评价线性回归为EHV-2的qPCR的性能（ 图4）：U 的LiNi是计算每个确定的线性不确定我质粒水平从标准偏差（SD'i）和平均偏差。确定由下式给出将合并的线性不确定性（U LIN）EHV-2的qPCR的： 注意：偏置接受由实验室指定（通常绝对偏差0.25日志10）和对应于最低值和0.5日志10（数量在日志10拷贝数测定）的最高值之间的差。 üLIN </sUB>值可以帮助比较来自不同实验室的qPCR的性能。 确定定量RT-PCR（LOQ PCR）的定量限：LOQ PCR是最低的浓度与用于线性范围（ 表3）的偏置0.25日志10。 5.表征全体分析方法（从DNA提取到定量RT-PCR结果） 注意：在整个方法的特性是必要的，以获得的qRT-PCR数据（ 即所有步骤的验证，从呼吸道样品DNA的提取（见第1）至靶的扩增和定量（见第2 ））。 建立在PCR反应中的拷贝数和本与式生物样品中的拷贝数之间的对应关系： 。 该<img alt="5.1-2" src="“/files/ftp_upload/53672/5.1-2.jpg”/">是质粒拷贝在PCR反应的数目， 被加入到PCR样品的体积混合进行放大， 被缓冲液AVE的体积来洗脱核酸和是所提取的样品的体积。 测试整个分析方法的灵敏度和特异性注意：只有知超高压-2阳性（或负）样品在本节中使用。 由目标（超高压-2）分析阳性样品测试的定量RT-PCR方法的“敏感性”。 选择超高压-2阳性的DNA样本，以前的特点（正状态）。 如第1描述为第2节进行扩增过程中提取的核酸。 确定真正的阳性（阳性样品数量它们是正与该RT-PCR）和假阴性（阳性样品这是负与该RT-PCR的许多已知的）。 通过分析阴性样品测试的定量RT-PCR方法的“专一” 选择超高压-2阴性DNA样本（负面状态）。 如第1描述为第2节进行扩增过程中提取的核酸。 确定真实底片（这是已知的与本的RT-PCR阴性阴性样品）和假阳性（称为负样本它们是正与该RT-PCR）的数目的数目。 计算“诊断的敏感性”（SE）和“诊断特异性”全法（SP）（ 表4）如下：SE =和SP =实数实阳性数/（真阳性+假阴性的数量）真正的负底片/（数S +假阳性）（ 见表4）。 计算与格瑞纳和加德纳关系12,20的公式整个方法的敏感性和特异性的95％置信区间： 其中e是估计误差，θ是硒（或SP）和正分析的样品的数目。 注意：对于一个小数目的样本，使用施瓦茨表根据AFNOR规范12来计算整个方法的敏感性和特异性的95％置信区间。 资源负材料的制备整个分析方法的表征注意：为了决定整个方法（LOD 方法和LOQ 法 ）的检测和定量的极限，质粒的已知浓度添加到已知是自由的生物样品的目标（EHV-2在这种情况下）。这些样品中，与量化质粒一起，构成与确定LOD 方法和LOQ 方法阳性标准。 确认用于构造阳性标准的生物样品在不存在靶的（EHV-2）。 选择不同的已知的负面生物样品。 如第1描述为第2节执行扩增程序中提取生物样本。 经确认不存在这些样品中的PCR信号的缺失目标。 注意：使用同一底片资源材质为5.4和5.5之间的所有步骤。 池不同的负样本以获得15毫升资源负材料（必要的完整的验证一个体积）。免除135微升这种消极的资源材料为100管。保持管在+ 4℃或在-80℃下长期贮存。 利米整体分析方法的检测效应的T 决定整个方法的消减区。 分配45微升的超纯水在6管。 执行质粒6十倍系列稀释。传送从对应于10 7的LOD 95％的PCR（如第4.3.10确定）到管45微升超纯水的质粒工作稀释度5微升。涡短暂离心管。在连续稀释重复步骤5.4.1.2，直到最后管已收到质粒。 从质粒的每个稀释至2管135微升阴性资源材料转移5微升获得2个重复的6绝对的标准。涡短暂离心。 如第1描述为第2节执行扩增程序执行2重复了6个阳性标准提取。 确定减排区域：最后浓度之间的区域质粒给出阳性信号和表示无信号第一浓度的entration。 方法的检测（LOD 方法 ）的限制，通过2个独立试验所确定注：执行2个独立的试验，以确定检测整个方法（LOD 法 ）的限制。 开始用质粒工作稀释度是4倍以上的浓缩该给了一个阳性信号质粒的最后浓度（见5.4.1.5）6两倍连续稀释。 分配25μl的超纯水在6管。 执行质粒的5两倍连续稀释液。传递来自质粒工作稀释25微升（如第5.4.2.1测定）与25微升的超纯水的管。涡短暂离心管。在连续稀释重复步骤5.4.2.3，直到最后管已收到质粒。 从plasmi每个稀释度将5微升d可4管135微升负的资源材料，以获得4个重复的5绝对的标准。涡，短暂离心管。 如第1描述为第2节执行扩增程序执行4个重复的5个阳性标准提取。 重复步骤5.4.2.1至5.4.2.5一旦获得8次重复质粒浓度的每个级别。 计数阳性重复出8重复次数为质粒浓度的每个级别。 确定LOD 方法 。该方法检测限是指8复制出8次重复是积极的（如第5.4.2.7所述）最后一个级别。 线性范围和限价整体分析方法的测定注意：要确定整个方法（LOQ 法 ）定量限，加质粒的已知浓度生物已知的样品是免费的目标（超高压-2在这种情况下）的。这些样本构成绝对的标准来确定定量限方法 。 分配45微升的超纯水在6管。 执行质粒6十倍系列稀释。传送从对应于10 7的LOD 方法 （如在第5.4.2.8确定）到管45微升超纯水的质粒工作稀释度5微升。涡短暂离心管。重复步骤5.5.2直到在连续稀释的最后管已接收到质粒。 将5微升从质粒的每个稀释至2管135微升负的生物资源材料获得2次重复的6绝对的标准。涡短暂离心。 如第1的描述执行扩增程序部分所述执行2重复了6个阳性标准提取2.重复步骤5.5.1到5.5.4三次。 为了评估和验证方法的定量性定义一个准确资料。 定义为实验室整个方法的可接受极限。在这个协议中，可接受限制由鲮定义为±0.75日志10 弗兰克·邓库姆。 对于一项试验中，微量的第一线性回归Y = AX + B（a是斜率，b是截距）与对应于各估计值的标准曲线的Ct值中的一个复制。与该第一线性回归，计算Ct值的用于该第一标准曲线的重复拷贝数的实验值。重复步骤5.5.5.2与Ct值的第二次重复，以获得一第二线性回归并计算用于第二标准曲线的Ct值的第二次重复的拷贝数的实验值。 <li>重复步骤5.5.5.2与第二和第三个试验。 计算根据NF U47-600-2 12各质粒级别的精度，真实性和准确性的限制。 创建电子表格来编译所有标准点（5.5.5.4）的信息，并创建与5.5.5.1先前定义的可接受范围的精度信息和数据的沿正确度的下限和上限值的精度在5.5计算.5.4（ 图5）。 确定LOQ 方法 ：这对应于与正确度0.75日志10标准曲线的最低浓度作为用于5.5.5.5计算出的线性范围。 重复性和再现性评价注意：使用和重复测量（变异系数，或CV =标准偏差的平均值的标准差之间的比率检查重复性和再现性/意思）。 1分析员评估整体方法的重复性： 选择3与3个不同的病毒基因组的负载（先前PCR中检测例如）生物样品。 提取8次重复的3个样品的如第1描述为第2节进行放大操作。 计算的平均值和收集每个样品的Ct值的标准偏差。 计算使用下式CV =标准偏差内的测定的CV /平均。 3分析师评估整体方法的再现： 选择3生物样品与3个不同的病毒基因组的负载（以前在PCR检测为例） 提取2次重复在5.6.2.1所选择的3个样品的（如在第1节中所述）。在第2节重复2独立分析师5.6.2.2描述的步骤进行扩增过程。 计算平均值和标准偏差收集每个样品的Ct值。 计算使用公式CV =标准偏差的测定间CV /意思。