Summary

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

Published: July 01, 2011
doi:

Summary

מאמר זה מציג cytometry מבוססי זרימת שיטה לחקור את הרכב החיסון של aortas. העיתון גם מדגים טכניקה נוספת המאפשרת לבחון adventitia שמסביב קיר כלי בנפרד. שיטה זו פותחת אפשרויות לבצע ניתוחים phenotypical של לויקוציטים אבי העורקים וליישם מבחני החיסונית מספר מחקרים טרשת עורקים.

Abstract

טרשת עורקים היא תהליך דלקתי כרוני של כלי גודל בינוניים וגדולים אשר מאופיין על ידי היווצרות של פלאק המורכב תאים קצף, תאים של מערכת החיסון, כלי הדם לתאי השריר אנדותל וחלק, טסיות דם, תאי מטריקס, וגרעין שומנים עשירים עם נמק נרחב סיסטיק של הרקמות הסובבות. 1 נשק מולד אדפטיבית של התגובה החיסונית מעורבים בפיתוח ייזום, והתמדה של טרשת עורקים. 2, 3 יש גוף משמעותי של ראיות תת שונים של תאים חיסוניים, כגון מקרופאגים, דנדריטים תאים לימפוציטים מסוג T ו-B, נמצאים בתוך aortas של עכברים בריאים טרשת עורקים נוטה 4. בנוסף, תאים של מערכת החיסון נמצאים adventitia אבי העורקים המקיפים אשר טוען תפקיד חשוב של רקמת זה atherogenesis 2.

במשך זמן מה, גילוי כמותי של סוגים שונים של תאים חיסוניים, מצב ההפעלה שלהם, את ההרכב התאי בתוך הקיר אבי העורקים היה מוגבל על ידי RT-PCR ושיטות immunohistochemical למחקר של טרשת עורקים. ניסיונות נעשו כדי לבצע cytometry זרימה באמצעות aortas האדם, מספר בעיות, כגון autofluorescence גבוה, דווחו 5,6. פלאק טרשת עורקים האדם היו מתעכל עם collagenase 1, ותאי חינם נאספו מוכתם עבור CD14 + / + CD11c להדגיש macrophage הנגזרות תאים קצף. במחקר זה, ערוץ "מדומה" שימש כדי למנוע חיוביות שגויות מכתים. 6 חומרי נקרוטי המצטבר במהלך תהליך העיכול להצמיח כמות גדולה של פסולת שיוצר autofluorescence גבוהה בדגימות אבי העורקים. כדי לפתור בעיה זו, פאנל של בקרות שלילי וחיובי הוצע, אבל רק מכתים כפול יכול להיות מיושם בדגימות אלה. פיתחנו תזרים חדש cytometry מבוססי שיטה 7 לנתח את ההרכב תא החיסון ולאפיין את ההפעלה, ההפצה, התמיינות של תאים חיסוניים באבי העורקים בריא טרשת עורקים נוטה. שיטה זו מאפשרת את החקירה של הרכב תא החיסון של הקיר אבי העורקים ופותחת אפשרויות לשימוש מגוון רחב של שיטות אימונולוגיות לחקירות היבטים החיסונית של מחלה זו.

Protocol

1. בידוד של aortas Murine אישור ועדה מוסדית IACUC של ההליך נדרש לעבוד עם עכברים. הכן heparinzed PBS על ידי הוספת 1000 יחידות של הפרין סודיום עד 50 מ"ל PBS ואת הצינורית היפוך לערבב. הכן את צינור איסוף ר…

Discussion

כאן, אנו מציגים שיטה זרימה cytometry מבוססי לחקירה של הרכב של תא החיסון aortas Murine. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא היכולת לנתח תאים חיסוניים אבי העורקים בכל הרמות תא בודד כדי לאפיין את מצב ההפעלה של לויקוציטים אבי העורקים. שיטה זו אינה מוגבלת aortas Murine ואנחנו (נתונים שלא פורסמו) ו?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק: PO1 HL55798 (כדי KL) ו – American Heart Association המדען פיתוח גרנט 0525532U (אל למשל).

Materials

Material Catalog Number Company
Collagenase XI C7657 Sigma-Aldrich
Hyaluronidase H3506 Sigma-Aldrich
DNase I, type 2 D4527 Sigma-Aldrich
Collagenase I C0130 Sigma-Aldrich
Collagenase II LS004174 Worthington Biochemical Corporation
Elastase LS002292 Worthington Biochemical Corporation

Referenzen

  1. Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-2341 (2000).
  2. Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
  3. Hansson, G. K., Libby, P. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword. Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).
  4. Galkina, E., Ley, K. Leukocyte influx in atherosclerosis. Curr Drug Targets. 812, 1239-1248 (2007).
  5. Bonanno, E., Mauriello, A., Partenzi, A., Anemona, L., Spagnoli, L. G. Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study. Cytometry. 39, 158-165 (2000).
  6. Liu-Wu, Y., Svenningsson, A., Stemme, S., Holm, J., Wiklund, O. Identification and analysis of macrophage-derived foam cells from human atherosclerotic lesions by using a “mock” FL3 channel in flow cytometry. Cytometry. 29, 155-164 (1997).
  7. Galkina, E., Kadl, A., Sanders, J., Varughese, D., Sarembock, I. J., Ley, K. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. J Exp Med. 203, 1273-1282 (2006).
  8. Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).
  9. Smith, E., Prasad, K. M., Butcher, M. Blockade of interleukin-17A results in reduced atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation. 121, 1746-1755 (2010).
  10. Eid, R. E., Rao, D. A., Zhou, J. Interleukin-17 and interferon-gamma are produced concomitantly by human coronary artery-infiltrating T cells and act synergistically on vascular smooth muscle cells. Circulation. 119, 1424-1432 (2009).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas. J. Vis. Exp. (53), e2848, doi:10.3791/2848 (2011).

View Video