Transduktion för att märka PDX tumörceller: Introducerar Lentivirus som uttrycker fluorescerande markör i tumörcellen in vitro

1. Transduktion av PDX-härledda tumörceller

1. Centrifuge dissociated tumör celler på 300 g x 5 min och återanvänds i 2 ml mammosphere media. Räkna livskraftiga celler med trypan blue exclusion (Återanvända smälta celler i 5 ml tvättbuffert och räkna både livskraftiga och icke-livskraftiga celler med trypan blue exclusion. Blanda kort 50 μl celler och 50 μl trypanblått och räkna trypanblå exklusive celler med hjälp av en hemocytometer).
2. Bered 10 ml mammosfärmedier som innehåller 8 μg/ml polybren (2 μl polybren i lager per ml media).
3. Bestäm volymen som behövs för 2 x 10⁵ livskraftiga tumörceller. Centrifugceller vid 300 x g i 5 min och återanvänd pellet i 2 ml polybreninnehållande media. Platta 2 x 10⁵ livskraftiga tumörceller per brunn i en 6-brunn ultra-låg vidhäftande vävnad kulturplatta.
   OBS: Detta är ett optimalt antal celler som krävs för transduktion med en lentiviral vektor.
   VARNING! Lentivirala partiklar och alla förbrukningsvaror som används med lentivirala partiklar bör hanteras enligt institutionella förfaranden för rekombinanta DNA-biofarliga ämnen.
   OBS: Lentiviral transduktion av primära bröstceller gynnar starkt myoepithelial celler som kan leda till dålig märkning av luminal celler och urval av subpopulationer av tumörceller under märkning.
4. Inkubera viruset med 200 mU/ml neuraminidas vid 37 °C i 1 timme före transduktion för att öka bindningen av viruspartiklar till olika subpopulationer av primära celler och korrigera för denna potentiella bias.
5. Tillsätt lentivirala partiklar vid 10 MOI (2 x 10⁶ TU för 2 x 10⁵ livskraftiga celler) om PDX-dissocierade celler är uttömda från Lin+ musceller eller berikade i EpCam+-celler. Tillsätt lentivirala partiklar vid 30 MOI (6 x 10⁶ TU för 2 x 10⁵ livskraftiga celler) om du använder icke-berikade PDX-dissocierade celler.
   OBS: Den ökade MOI möjliggör effektiv transduktion även i närvaro av stora mängder skräp och döda celler i råextrakt. Håll en bra med omärkta celler för att fungera som en kontroll för livskraft och transduktionseffektivitet.
6. Snurra för att blanda virus med celler. Inkubera vid 37 °C, 5% CO₂ i upp till 96 timmar. Tillsätt 500 μl färskt mammosfärmedier 24 timmar efter transfection. Celler fästs inte på plattor, aspirerar inte media.

2. Utvärdering av transduktionseffektivitet och återimplantation av märkta celler hos immunkomprometterade möss

1. Övervaka uttrycket av den spårbara markören (GFP) var 24:e timme med hjälp av ett fluorescerande mikroskop vid 10X förstoring.
   OBS: GFP-uttryck kan observeras så tidigt som 24 timmar efter infektion men i de flesta PDXS GFP uttryck är tydligt synlig efter 72 timmar (Figur 1).
2. Uppskatta effektiviteten av transduktion genom att utvärdera procentandelen GFP + celler inom den totala brunnen.
   OBS: Eftersom kulturer innehåller tumörceller, kvarvarande stromal celler och döda celler i olika grader, kan brunnar med så låga som 10% GFP + celler implanteras i en värdmus.
3. Överför transduced celler från 6-brunnsplattor till ett 15 ml koniskt rör. Tillsätt 1 ml mammosfärmedia till brunnen för att samla alla celler som lämnats kvar. Lägg på is.
4. Tillsätt 10 ml HBSS/hepes till transducerade celler och centrifugera vid 300 x g i 5 min, 4 °C. Aspirera försiktigt supernatant och återanvänd i 50 μl källarmatrisextrakt (BME) på is.
   OBS: BME alikvoter måste tinas på is, 1- 2 timmar före användning. BME kommer att stelna vid rumstemperatur; hålla alltid på is.
5. Ladda BME-inbäddade celler i en 0,5 ml insulinspruta, håll på is och för till djuranläggningen för återimplantation i NSG-möss.

Bild 1: Spårning av transduktionseffektivitet i dissocierade PDX-celler. A) PDX-dissocierade celler berikade för mänskliga epitelceller (Lin + utarmning) 24 timmar efter transduktion med pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro lentivirala partiklar. B) PDX-dissocierade celler från ett separat experiment, utan epitelcellberikning, 72 timmar efter transduktion med pHAGE-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. Båda panelerna visar levande celler. BF: Ljusa fältbilder, stapel representerar 50 μm