Isolando células imunes do cérebro e crânio de camundongos

O cérebro, o centro do sistema nervoso, é protegido pelo crânio. Abaixo do crânio estão três camadas de tecido conjuntivo conhecidas como meninges – dura-máter, aracnóide e pia-máter. O líquido cefalorraquidiano (LCR) circula no espaço subaracnóideo entre a aracnóide e a pia-máter, amortecendo o cérebro e também removendo os resíduos pelo sistema glinfático ^1,2. Juntos, essa arquitetura exclusiva fornece um ambiente seguro e de suporte que mantém a estabilidade do cérebro e o protege de possíveis lesões.

O cérebro há muito é considerado imunoprivilegiado. No entanto, essa noção foi parcialmente abandonada, pois evidências crescentes indicam que, além da micróglia residente no parênquima, as bordas do cérebro, incluindo o plexo coróide e as meninges, hospedam uma gama diversificada de células imunes³. Essas células desempenham papéis críticos na manutenção da homeostase, na vigilância da saúde do cérebro e no início da resposta imune à lesão cerebral. Notavelmente, descobertas recentes indicam que o crânio está envolvido na imunidade das meninges e pode contribuir para a resposta imune no cérebro após a lesão. Em 2018, Herisson et al. fizeram uma descoberta seminal de canais vasculares diretos que ligam a medula óssea do crânio às meninges, estabelecendo assim uma rota anatômica para a migração de leucócitos ^4,5. Posteriormente, Cugurra e col. demonstraram que muitas células mieloides (por exemplo, monócitos e neutrófilos) e células B nas meninges não se originam do sangue⁶. Usando técnicas como transplante de retalho ósseo da calvária e regimes de irradiação seletiva, os autores forneceram evidências convincentes de que a medula óssea do crânio serve como fonte local de células mieloides nas meninges, bem como no parênquima do SNC após lesão do SNC⁶. Além disso, outro estudo propôs que as células B meníngeas são constantemente supridas pela medula óssea do crânio⁷. Mais recentemente, uma nova estrutura, denominada saída do manguito aracnóide (ECA), foi identificada como uma porta de entrada direta entre a dura-máter e o cérebro para o tráfego de células imunes⁸.

Essas descobertas empolgantes têm implicações importantes para a origem da infiltração de células imunes no cérebro lesionado (por exemplo, após acidente vascular cerebral isquêmico). Um grande corpo de evidências indicou que, após o AVC, muitas células imunológicas se infiltram no cérebro, contribuindo tanto para danos cerebrais agudos quanto para a recuperação crônica do cérebro. A noção convencional é que essas células são leucócitos circulantes no sangue que se infiltram no cérebro, o que é amplamente facilitado por danos na barreira hematoencefálica induzidos por derrame. No entanto, essa noção foi contestada. Em um estudo, as células imunes no crânio e na tíbia de camundongos foram rotuladas de forma diferente e, 6 h após o AVC, uma diminuição significativamente maior de neutrófilos e monócitos foi encontrada no crânio vs. a tíbia e mais neutrófilos derivados do crânio estavam presentes no cérebro isquêmico. Esses dados sugerem que, na fase aguda do AVC, os neutrófilos no cérebro isquêmico se originam principalmente da medula óssea do crânio⁴. Curiosamente, o LCR pode orientar essa migração. De fato, dois relatórios recentes demonstraram que o LCR pode transmitir diretamente sinais de sinalização do cérebro para a medula óssea do crânio através dos canais do crânio e instruir a migração celular e a hematopoiese na medula óssea do crânio após lesão do SNC ^9,10.

À luz dessas descobertas recentes, tornou-se importante analisar as mudanças nas células imunes no cérebro e na medula óssea do crânio, ao estudar a resposta imune a distúrbios cerebrais. Em tais investigações, um número suficiente de células imunes de alta qualidade é necessário para análises a jusante, como classificação de células, análise de citometria de fluxo e sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq). Aqui, o objetivo geral é apresentar dois procedimentos otimizados para a preparação de suspensões unicelulares a partir do tecido cerebral e da medula óssea do crânio. É importante notar que a calvária (osso frontal, osso occipital e ossos parietais) do crânio é normalmente usada para extrair medula óssea, e essa medula óssea é especificamente referida como medula óssea do crânio ao longo deste estudo.