マウスの脳と頭蓋骨からの免疫細胞の単離

神経系の中枢である脳は、頭蓋骨によって保護されています。頭蓋骨の下には、髄膜として知られる結合組織の3つの層(硬膜、くも膜、軟膜)があります。脳脊髄液(CSF)は、くも膜母と軟膜の間のくも膜下腔を循環し、脳を緩衝し、またリンパ系を介して老廃物を取り除きます^1,2。このユニークなアーキテクチャは、脳の安定性を維持し、潜在的な損傷から脳を保護する安全で支援的な環境を提供します。

脳は長い間、免疫特権があると考えられてきました。しかし、実質に常在するミクログリアに加えて、脈絡叢や髄膜を含む脳の境界には多様な免疫細胞が宿主であるという証拠が増えているため、この概念は部分的に放棄されています³。これらの細胞は、恒常性の維持、脳の健康の監視、および脳損傷に対する免疫応答の開始に重要な役割を果たします。特に、最近の知見では、頭蓋骨が髄膜免疫に関与しており、損傷後の脳内の免疫応答に寄与している可能性が示されています。2018年、Herissonらは、頭蓋骨骨髄と髄膜をつなぐ直接的な血管チャネルの独創的な発見をし、それによって白血球の移動の解剖学的経路を確立しました^4,5。その後、Cugurraらは、髄膜の多くの骨髄細胞(単球や好中球など)とB細胞が血液に由来しないことを実証しました⁶。著者らは、頭蓋骨骨移植や選択的照射レジメンなどの技術を用いて、頭蓋骨骨髄が髄膜の骨髄細胞の局所供給源として、また中枢神経系損傷後の中枢神経系実質の局所供給源として機能するという説得力のある証拠を提供し^た6。さらに、別の研究では、髄膜B細胞が頭蓋骨骨髄⁷によって常に供給されていることが提唱された。最近では、くも膜下カフ出口(ACE)と呼ばれる新しい構造が、免疫細胞の輸送のための硬膜と脳との間の直接のゲートウェイとして特定されています⁸。

これらの興味深い知見は、損傷した脳への免疫細胞の浸潤の起源(虚血性脳卒中後など)に重要な意味を持っています。脳卒中後、多くの免疫細胞が脳に浸潤し、急性脳損傷と慢性脳回復の両方に寄与することが、多くの証拠で示されています。従来の考え方では、これらの細胞は血液中の白血球を循環させ、脳に浸潤していると考えられていましたが、これは主に脳卒中による血液脳関門の損傷によって促進されます。しかし、この概念は挑戦されています。ある研究では、マウスの頭蓋骨と脛骨の免疫細胞に異なる方法で標識され、脳卒中後6時間で、頭蓋骨と好中球と単球の有意に大きな減少が見られました。脛骨、およびより多くの頭蓋骨由来の好中球が虚血性脳に存在していました。これらのデータは、急性脳卒中期において、虚血性脳の好中球は主に頭蓋骨骨髄に由来することを示唆しています⁴。興味深いことに、CSFはこの移行を導くかもしれません。実際、最近の2つの報告では、CSFが脳からのシグナル伝達の手がかりを頭蓋骨チャネルを介して頭蓋骨骨髄に直接中継し、CNS損傷後の頭蓋骨骨髄の細胞移動と造血を指示できることが示されました^9,10。

これらの最近の知見を踏まえて、脳疾患に対する免疫応答を研究する際には、脳と頭蓋骨骨髄の免疫細胞の変化を解析することが重要になってきています。このような研究では、細胞ソーティング、フローサイトメトリー解析、シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)などのダウンストリーム解析に十分な数の高品質な免疫細胞が必要です。ここでは、全体的な目標は、脳組織と頭蓋骨骨髄から単一細胞懸濁液を調製するための 2 つの最適化された手順を提示することです。頭蓋骨の頭蓋骨(前頭骨、後頭骨、頭頂骨)は通常、骨髄の抽出に使用され、この骨髄は、この研究全体で特に頭蓋骨骨髄と呼ばれることに注意することが重要です。