Isolamento delle cellule immunitarie dal cervello e dal cranio del topo

Il cervello, il fulcro centrale del sistema nervoso, è protetto dal cranio. Sotto il cranio ci sono tre strati di tessuto connettivo noti come meningi: la dura madre, l’aracnoide e la pia madre. Il liquido cerebrospinale (CSF) circola nello spazio subaracnoideo tra l’aracnoide e la pia madre, ammortizzando il cervello e rimuovendo anche i rifiuti attraverso il sistema glinfatico ^1,2. Insieme, questa architettura unica fornisce un ambiente sicuro e di supporto che mantiene la stabilità del cervello e lo protegge da potenziali lesioni.

Il cervello è stato a lungo considerato immuno-privilegiato. Tuttavia, questa nozione è stata parzialmente abbandonata poiché prove crescenti indicano che, oltre alle microglia residenti nel parenchima, i bordi del cervello, compreso il plesso coroideo e le meningi, ospitano una vasta gamma di cellule immunitarie³. Queste cellule svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento dell’omeostasi, nella sorveglianza della salute del cervello e nell’avvio della risposta immunitaria alle lesioni cerebrali. In particolare, recenti scoperte indicano che il cranio è coinvolto nell’immunità delle meningi e può contribuire alla risposta immunitaria nel cervello dopo una lesione. Nel 2018, Herisson et al. hanno fatto una scoperta fondamentale dei canali vascolari diretti che collegano il midollo osseo del cranio alle meningi, stabilendo così un percorso anatomico per la migrazione dei leucociti ^4,5. Successivamente, Cugurra et al. hanno dimostrato che molte cellule mieloidi (ad esempio, monociti e neutrofili) e le cellule B nelle meningi non originano dal sangue⁶. Utilizzando tecniche come il trapianto di lembo osseo calvario e regimi di irradiazione selettiva, gli autori hanno fornito prove convincenti che il midollo osseo del cranio funge da fonte locale per le cellule mieloidi nelle meningi e per il parenchima del SNC dopo una lesione del SNC⁶. Inoltre, un altro studio ha proposto che le cellule B meningee siano costantemente fornite dal midollo osseo del cranio⁷. Più recentemente, una nuova struttura, chiamata uscita della cuffia aracnoidea (ACE), è stata identificata come una porta diretta tra la dura madre e il cervello per il traffico di cellule immunitarie⁸.

Questi interessanti risultati hanno importanti implicazioni per l’origine dell’infiltrazione delle cellule immunitarie nel cervello danneggiato (ad esempio, dopo un ictus ischemico). Un ampio corpus di prove ha indicato che dopo l’ictus, molte cellule immunitarie si infiltrano nel cervello, contribuendo sia al danno cerebrale acuto che al recupero cerebrale cronico. L’idea convenzionale è che queste cellule siano leucociti circolanti nel sangue che si infiltrano nel cervello, il che è in gran parte facilitato dal danno alla barriera emato-encefalica indotto dall’ictus. Tuttavia, questa nozione è stata messa in discussione. In uno studio, le cellule immunitarie nel cranio e nella tibia dei topi sono state etichettate in modo diverso e, a 6 ore dall’ictus, è stata riscontrata una diminuzione significativamente maggiore dei neutrofili e dei monociti nel cranio rispetto all’ictus. La tibia e altri neutrofili derivati dal cranio erano presenti nel cervello ischemico. Questi dati suggeriscono che nella fase acuta di ictus, i neutrofili nel cervello ischemico originano principalmente dal midollo osseo del cranio⁴. È interessante notare che il liquido cerebrospinale può guidare questa migrazione. Infatti, due recenti rapporti hanno dimostrato che il liquido cerebrospinale può trasmettere direttamente segnali di segnalazione dal cervello al midollo osseo del cranio attraverso i canali del cranio e istruire la migrazione cellulare e l’emopoiesi nel midollo osseo del cranio dopo una lesione del SNC ^9,10.

Alla luce di queste recenti scoperte, è diventato importante analizzare i cambiamenti nelle cellule immunitarie sia nel cervello che nel midollo osseo del cranio, quando si studia la risposta immunitaria ai disturbi cerebrali. In tali indagini, è necessario un numero sufficiente di cellule immunitarie di alta qualità per le analisi a valle come lo smistamento cellulare, l’analisi della citometria a flusso e il sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq). Qui, l’obiettivo generale è quello di presentare due procedure ottimizzate per la preparazione di sospensioni unicellulari dal tessuto cerebrale e dal midollo osseo del cranio. È importante notare che la calvaria (osso frontale, osso occipitale e ossa parietali) del cranio viene tipicamente utilizzata per estrarre il midollo osseo e questo midollo osseo è specificamente indicato come midollo osseo del cranio in questo studio.