Caratterizzazione di un ceppo patogeno di Escherichia coli derivato da allevamenti di Oreochromis spp. che utilizzano il sequenziamento dell'intero genoma

L’acquacoltura è uno dei settori di produzione alimentare in più rapida crescita in tutto il mondo e le sue pratiche di produzione sono destinate a soddisfare la crescente domanda alimentare per il consumo umano. La produzione mondiale dell’acquacoltura è triplicata da 34 milioni di tonnellate (Mt) nel 1997 a 112 Mt nel 2017¹. I principali gruppi di specie, che hanno contribuito a quasi il 75% della produzione, sono stati alghe, carpe, bivalvi, pesci gatto e tilapia (Oreochromis spp.) ¹. Tuttavia, la comparsa di malattie causate da entità microbiche è inevitabile a causa dell’allevamento ittico intensivo, con conseguenti potenziali perdite economiche².

L’uso di antibiotici nelle pratiche di allevamento ittico è ben noto per prevenire e curare le infezioni batteriche, il principale fattore limitante della produttività ^3,4. Tuttavia, gli antibiotici residui si accumulano nei sedimenti di acquacoltura e nell’acqua, esercitando una pressione selettiva e modificando le comunità batteriche associate ai pesci e residenti 5,6,7,8. Di conseguenza, l’ambiente dell’acquacoltura funge da serbatoio per i geni di resistenza antimicrobica (ARG) e per l’ulteriore comparsa e diffusione di batteri resistenti agli antibiotici (ARB) nell’ambiente circostante⁹. Oltre ai patogeni batterici comunemente osservati che colpiscono le pratiche di allevamento ittico, si incontrano spesso membri della famiglia delle Enterobacteriaceae, compresi ceppi patogeni umani di Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. e Salmonella spp.10. E. coli è il microrganismo più comune isolato dalla farina di pesce e dall’acqua negli allevamenti ittici 11,12,13,14,15.

E. coli è un versatile batterio gram-negativo che abita il tratto gastrointestinale di mammiferi e uccelli come membro commensale del loro microbiota intestinale. Tuttavia, E. coli possiede una capacità altamente adattativa di colonizzare e persistere in diverse nicchie ambientali, tra cui suolo, sedimenti, cibo e acqua¹⁶. A causa del guadagno e della perdita genica attraverso il fenomeno del trasferimento genico orizzontale (HGT), E. coli si è rapidamente evoluto in un patogeno resistente agli antibiotici ben adattato, in grado di causare un ampio spettro di malattie nell’uomo e negli animali^17,18. In base all’origine dell’isolamento, le varianti patogene sono definite come E. coli patogeno intestinale (InPEC) o E. coli patogeno extra-intestinale (ExPEC). Inoltre, InPEC ed ExPEC sono sottoclassificati in patotipi ben definiti in base alla manifestazione della malattia, al background genetico, ai tratti fenotipici e ai fattori di virulenza (VF)^16,17,19.

La coltura tradizionale e le tecniche molecolari per i ceppi patogeni di E. coli hanno permesso la rapida individuazione e identificazione di diversi patotipi. Tuttavia, possono richiedere molto tempo, essere laboriosi e spesso richiedere un’elevata formazione tecnica¹⁹. Inoltre, nessun singolo metodo può essere utilizzato per studiare in modo affidabile tutte le varianti patogene di E. coli a causa della complessità del loro background genetico. Attualmente, questi inconvenienti sono stati superati con l’avvento delle tecnologie HTS (High-Throughput Sequencing). Gli approcci di sequenziamento dell’intero genoma (WGS) e gli strumenti bioinformatici hanno migliorato l’esplorazione del DNA microbico in modo economico e su larga scala, facilitando la caratterizzazione approfondita dei microbi in un’unica corsa, comprese le varianti patogene strettamente correlate^20,21,22. A seconda delle domande biologiche, diversi strumenti bioinformatici, algoritmi e database possono essere utilizzati per eseguire l’analisi dei dati. Ad esempio, se l’obiettivo principale è valutare la presenza di ARG, VF e plasmidi, strumenti come ResFinder, VirulenceFinder e PlasmidFinder, insieme ai loro database associati, potrebbero essere un buon punto di partenza. Carriço et ^al.22 hanno fornito una panoramica dettagliata dei diversi software bioinformatici e dei relativi database applicati per l’analisi microbica WGS, dalla pre-elaborazione dei dati grezzi all’inferenza filogenetica.

Diversi studi hanno dimostrato l’ampia utilità del WGS per l’interrogazione del genoma per quanto riguarda gli attributi di resistenza antimicrobica, il potenziale patogeno e il monitoraggio dell’emergenza e delle relazioni evolutive di varianti clinicamente rilevanti di E. coli provenienti da diverse origini^23,24,25,26 . WGS ha permesso l’identificazione dei meccanismi molecolari alla base della resistenza fenotipica agli antimicrobici, compresi quei meccanismi di resistenza rari o complessi. Ciò avviene attraverso la rilevazione di varianti ARG acquisite, nuove mutazioni nei geni bersaglio dei farmaci o regioni promotrici^27,28. Inoltre, WGS offre il potenziale per dedurre profili di resistenza antimicrobica senza richiedere conoscenze preliminari sul fenotipo di resistenza di un ceppo batterico²⁹. In alternativa, WGS ha permesso la caratterizzazione degli elementi genetici mobili (MGE) che portano sia la resistenza antimicrobica che le caratteristiche di virulenza, che ha guidato l’evoluzione del genoma batterico dei patogeni esistenti. Ad esempio, l’applicazione di WGS durante l’indagine sull’epidemia tedesca di E. coli nel 2011 ha portato alla scoperta delle caratteristiche genomiche uniche di un patotipo di E. coli apparentemente nuovo; È interessante notare che questi ceppi epidemici hanno avuto origine dal gruppo enteroaggregativo E. coli (EAEC), che ha acquisito il profago che codifica la tossina Shiga dal patotipo enteroemorragico E. coli (EHEC)³⁰.

Questo lavoro presenta un adattamento metodologico del flusso di lavoro per WGS batterico utilizzando un sequenziatore da banco. Inoltre, viene fornita una pipeline bioinformatica utilizzando strumenti basati sul web per analizzare le sequenze risultanti e supportare ulteriormente i ricercatori con competenze bioinformatiche limitate o assenti. I metodi descritti hanno permesso di chiarire la resistenza antimicrobica, la virulenza e le caratteristiche del mobiloma di un ceppo patogeno di E. coli ACM5, isolato nel 2011 da Oreochromis spp. nell’entroterra coltivato a Sinaloa, Messico¹².