Caracterização de uma cepa patogênica de Escherichia coli derivada de Oreochromis spp. Fazendas usando sequenciamento de genoma completo

A aquicultura é um dos setores produtores de alimentos que mais crescem em todo o mundo, e suas práticas de produção destinam-se a satisfazer a crescente demanda de alimentos para consumo humano. A produção aquícola global triplicou de 34 milhões de toneladas (Mt) em 1997 para 112 Mt em 2017¹. Os principais grupos de espécies, contribuindo para quase 75% da produção, foram algas marinhas, carpas, bivalves, bagres e tilápias (Oreochromis spp.) ¹. No entanto, o aparecimento de doenças causadas por entidades microbianas é inevitável devido à piscicultura intensiva, levando a potenciais perdas econômicas².

O uso de antibióticos em práticas de piscicultura é bem conhecido por prevenir e tratar infecções bacterianas, principal fator limitante da produtividade ^3,4. No entanto, os antibióticos residuais se acumulam nos sedimentos e na água da aquicultura, exercendo pressão seletiva e modificando as comunidades bacterianas associadas aos peixes e residentes ^5,6,7,8. Consequentemente, o ambiente de aquicultura serve como um reservatório para genes de resistência antimicrobiana (ARGs) e o surgimento e disseminação de bactérias resistentes a antibióticos (ARB) no meio circundante⁹. Além dos patógenos bacterianos comumente observados que afetam as práticas de piscicultura, membros da família Enterobacteriaceae são frequentemente encontrados, incluindo cepas patogênicas humanas de Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. e Salmonella spp.10. E. coli é o microrganismo mais comum isolado da farinha de peixe e da água na piscicultura 11,12,13,14,15.

E. coli é uma bactéria gram-negativa versátil que habita o trato gastrointestinal de mamíferos e aves como um membro comensal de sua microbiota intestinal. No entanto, E. coli possui uma capacidade altamente adaptativa de colonizar e persistir em diferentes nichos ambientais, incluindo solo, sedimentos, alimentos e água¹⁶. Devido ao ganho e perda de genes através do fenômeno da transferência horizontal de genes (HGT), a E. coli evoluiu rapidamente para um patógeno resistente a antibióticos bem adaptado, capaz de causar um amplo espectro de doenças em humanos e animais^17,18. Com base na origem do isolamento, as variantes patogênicas são definidas como E. coli patogênica intestinal (InPEC) ou E. coli patogênica extra-intestinal (ExPEC). Além disso, o InPEC e o ExPEC são subclassificados em patótipos bem definidos de acordo com a manifestação da doença, antecedentes genéticos, características fenotípicas e fatores de virulência (FV)^16,17,19.

A cultura tradicional e as técnicas moleculares para cepas patogênicas de E. coli têm permitido a rápida detecção e identificação de diferentes patotipos. No entanto, podem ser demorados, trabalhosos e frequentemente requerem alto treinamento técnico¹⁹. Além disso, nenhum método único pode ser usado para estudar de forma confiável todas as variantes patogênicas de E. coli devido à complexidade de seu histórico genético. Atualmente, essas desvantagens foram superadas com o advento das tecnologias de sequenciamento de alto rendimento (HTS). Abordagens de sequenciamento de genoma completo (SGB) e ferramentas de bioinformática melhoraram a exploração do DNA microbiano de forma acessível e em larga escala, facilitando a caracterização aprofundada de micróbios em uma única execução, incluindo variantes patogênicas intimamente relacionadas^20,21,22. Dependendo das questões biológicas, várias ferramentas de bioinformática, algoritmos e bancos de dados podem ser usados para realizar a análise de dados. Por exemplo, se o objetivo principal é avaliar a presença de ARGs, VFs e plasmídeos, ferramentas como ResFinder, VirulenceFinder e PlasmidFinder, juntamente com seus bancos de dados associados, podem ser um bom ponto de partida. Carriço et ^al.22 forneceram uma visão detalhada dos diferentes softwares de bioinformática e bases de dados relacionadas aplicadas para análise microbiana WGS, desde o pré-processamento de dados brutos até a inferência filogenética.

Vários estudos têm demonstrado a ampla utilidade do WGS para a interrogação do genoma em relação aos atributos de resistência antimicrobiana, potencial patogênico e rastreamento do surgimento e relações evolutivas de variantes clinicamente relevantes de E. coli provenientes de diversas origens^23,24,25,26 . O WGS permitiu a identificação de mecanismos moleculares subjacentes à resistência fenotípica aos antimicrobianos, incluindo os mecanismos de resistência raros ou complexos. Isso ocorre por meio da detecção de variantes ARG adquiridas, novas mutações em genes-alvo de drogas ou regiões promotoras^27,28. Além disso, o WGS oferece o potencial de inferir perfis de resistência antimicrobiana sem a necessidade de conhecimento prévio sobre o fenótipo de resistência de uma cepa bacteriana²⁹. Alternativamente, o WGS permitiu a caracterização dos elementos genéticos móveis (MGEs) portadores de características de resistência antimicrobiana e virulência, o que impulsionou a evolução do genoma bacteriano dos patógenos existentes. Por exemplo, a aplicação de WGS durante a investigação do surto alemão de E. coli em 2011 resultou na descoberta das características genômicas únicas de um patótipo de E. coli aparentemente novo; Curiosamente, essas cepas de surto originaram-se do grupo enteroagregativo E. coli (EAEC), que adquiriu o prófago que codifica a toxina Shiga do patótipo³⁰ entero-hemorrágico de E. coli (EHEC).

Este trabalho apresenta uma adaptação metodológica do fluxo de trabalho para SGB bacterianos utilizando um sequenciador de bancada. Além disso, um pipeline de bioinformática é fornecido usando ferramentas baseadas na web para analisar as sequências resultantes e apoiar ainda mais os pesquisadores com experiência limitada ou nenhuma em bioinformática. Os métodos descritos permitiram a elucidação das características de resistência antimicrobiana, virulência e mobiloma de uma cepa patogênica de E. coli ACM5, isolada em 2011 de Oreochromis spp. cultivada no interior em Sinaloa, México¹².