אפיון זן Escherichia coli פתוגני שמקורו באוראוכרומיס spp. חוות המשתמשות בריצוף גנום שלם

חקלאות ימית היא אחד מענפי ייצור המזון הצומחים ביותר בעולם, ושיטות הייצור שלה נועדו לספק את הביקוש הגובר למזון לצריכה אנושית. ייצור החקלאות הימית העולמי שילש את עצמו מ-34 מיליון טון (Mt) ב-1997 ל-112 טון ב-2017¹. קבוצות המינים העיקריות, שתרמו לכמעט 75% מהייצור, היו אצות, קרפיונים, דו-חיים, שפמנון ואמנון (Oreochromis spp.) ¹. עם זאת, הופעת מחלות הנגרמות על ידי ישויות מיקרוביאליות היא בלתי נמנעת בגלל גידול דגים אינטנסיבי, המוביל להפסדים כלכליים פוטנציאליים².

שימוש באנטיביוטיקה בשיטות גידול דגים ידוע במניעה וטיפול בזיהומים חיידקיים, הגורם המגביל העיקרי בפרודוקטיביות ^3,4. עם זאת, שאריות אנטיביוטיקה מצטברות במשקעי חקלאות ימית ובמים, מפעילות לחץ סלקטיבי ומשנות את קהילות החיידקים הקשורות לדגים ואת קהילות החיידקים השוכנות ב-5,6,7,8. כתוצאה מכך, סביבת החקלאות הימית משמשת כמאגר לגנים של עמידות מיקרוביאלית (ARGs), ולהמשך הופעתם והתפשטותם של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה (ARB) בסביבה⁹. בנוסף לפתוגנים החיידקיים הנצפים בדרך כלל המשפיעים על שיטות גידול דגים, חברים ממשפחת Enterobacteriaceae נתקלים לעתים קרובות, כולל זנים פתוגניים אנושיים של Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp., ו סלמונלה spp.10. E. coli הוא המיקרואורגניזם הנפוץ ביותר המבודד מארוחות דגים ומים בגידול דגים 11,12,13,14,15.

E. coli הוא חיידק גראם שלילי רב-תכליתי המאכלס את מערכת העיכול של יונקים וציפורים כחבר קומנסלי במיקרוביוטה של המעיים שלהם. עם זאת, E. coli הם בעלי יכולת הסתגלות גבוהה להתיישב ולהתמיד בנישות סביבתיות שונות, כולל אדמה, משקעים, מזון ומים¹⁶. בגלל הרווח וההפסד של הגנים באמצעות תופעת העברת הגנים האופקית (HGT), E. coli התפתח במהירות לפתוגן עמיד לאנטיביוטיקה מותאם היטב, המסוגל לגרום לספקטרום רחב של מחלות בבני אדם ובבעלי חיים^17,18. בהתבסס על מקור הבידוד, וריאנטים פתוגניים מוגדרים כ- E. coli פתוגני מעיים (InPEC) או E. coli פתוגני חוץ-מעיים (ExPEC). יתר על כן, InPEC ו- ExPEC מסווגים לפתוטיפים מוגדרים היטב על פי ביטוי המחלה, הרקע הגנטי, תכונות פנוטיפיות וגורמי אלימות (VFs)^16,17,19.

תרבית מסורתית וטכניקות מולקולריות לזני E. coli פתוגניים אפשרו זיהוי וזיהוי מהירים של פתוטיפים שונים. עם זאת, הם עשויים להיות זמן רב, מייגע, ולעתים קרובות דורשים הכשרה טכנית גבוהה¹⁹. יתר על כן, לא ניתן להשתמש בשיטה אחת כדי לחקור באופן אמין את כל הגרסאות הפתוגניות של E. coli בגלל המורכבות של הרקע הגנטי שלהן. נכון לעכשיו, חסרונות אלה התגברו עם הופעתן של טכנולוגיות ריצוף בתפוקה גבוהה (HTS). גישות ריצוף גנום שלם (WGS) וכלים ביואינפורמטיים שיפרו את חקר הדנ”א המיקרוביאלי במחיר סביר ובקנה מידה גדול, ואפשרו אפיון מעמיק של מיקרובים בריצה אחת, כולל גרסאות פתוגניות קרובות^20,21,22. בהתאם לשאלות הביולוגיות, ניתן להשתמש במספר כלי ביואינפורמטיקה, אלגוריתמים ומאגרי מידע כדי לבצע ניתוח נתונים. לדוגמה, אם המטרה העיקרית היא להעריך את הנוכחות של ARGs, VFs ופלסמידים, כלים כגון ResFinder, VirulenceFinder ו- PlasmidFinder, יחד עם מסדי הנתונים המשויכים אליהם, עשויים להיות נקודת התחלה טובה. Carriço et ^al.22 סיפקו סקירה מפורטת של תוכנות הביואינפורמטיקה השונות ומסדי הנתונים הקשורים המיושמים לניתוח WGS מיקרוביאלי, החל מעיבוד נתונים גולמיים וכלה בהסקה פילוגנטית.

מספר מחקרים הוכיחו את התועלת הרחבה של WGS לחקירת גנום בנוגע לתכונות עמידות מיקרוביאלית, פוטנציאל פתוגני ומעקב אחר הופעתם והקשרים האבולוציוניים של גרסאות רלוונטיות מבחינה קלינית של E. coli שמקורן במקורות מגוונים^23,24,25,26 . WGS אפשרה לזהות מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס העמידות הפנוטיפית לאנטי-מיקרוביאלים, כולל אותם מנגנוני עמידות נדירים או מורכבים. זאת באמצעות איתור וריאנטים נרכשים של ARG, מוטציות חדשות בגנים של מטרות תרופות, או אזורים מקדמים^27,28. יתר על כן, WGS מציע את הפוטנציאל להסיק פרופילי עמידות מיקרוביאלית ללא צורך בידע מוקדם על פנוטיפ העמידות של זן חיידקי²⁹. לחלופין, WGS אפשרה לאפיין את האלמנטים הגנטיים הניידים (MGEs) הנושאים הן עמידות מיקרוביאלית והן תכונות של אלימות, מה שהניע את התפתחות הגנום החיידקי של פתוגנים קיימים. לדוגמה, היישום של WGS במהלך חקירת התפרצות E. coli הגרמנית בשנת 2011 הביא לחשיפת המאפיינים הגנומיים הייחודיים של פתוטיפ E. coli חדשני לכאורה; באופן מעניין, זני התפרצות אלה מקורם בקבוצת E. coli האנטרוגרגטיבית (EAEC), שרכשה את הנבואה המקודדת את רעלן שיגה מהפתוטיפ E. coli (EHEC) האנטרוהמורגי³⁰.

עבודה זו מציגה התאמה מתודולוגית של זרימת העבודה עבור WGS חיידקי באמצעות רצף benchtop. יתר על כן, צינור ביואינפורמטיקה מסופק באמצעות כלים מבוססי אינטרנט כדי לנתח את הרצפים המתקבלים ולתמוך עוד יותר בחוקרים עם מומחיות מוגבלת או ללא מומחיות בביואינפורמטיקה. השיטות המתוארות אפשרו להבהיר את העמידות האנטי-מיקרוביאלית, הווירוליות והתכונות הניידות של זן E. coli פתוגני ACM5, שבודד בשנת 2011 מאוראוכרומיס spp. שגודל בפנים הארץ בסינלואה, מקסיקו¹².