توصيف سلالة الإشريكية القولونية المسببة للأمراض المشتقة من مزارع Oreochromis spp. باستخدام تسلسل الجينوم الكامل
Summary
أدت جدوى استراتيجيات تسلسل الجينوم الكامل (WGS) باستخدام أدوات الطاولة إلى تبسيط استجواب الجينوم لكل ميكروب ذي صلة بالصحة العامة في بيئة معملية. يتم وصف التكيف المنهجي لسير العمل ل WGS البكتيرية كما يتم تقديم خط أنابيب المعلوماتية الحيوية للتحليل.
Abstract
يعتبر الاستزراع المائي أحد أسرع قطاعات إنتاج الأغذية نموا في جميع أنحاء العالم، ويشكل استزراع البلطي (Oreochromis spp.) الصنف الرئيسي من أسماك المياه العذبة المستزرعة. نظرا لأن ممارسات تربية الأحياء المائية عرضة للتلوث الميكروبي المستمد من مصادر بشرية المنشأ ، فإن هناك حاجة إلى استخدام المضادات الحيوية على نطاق واسع ، مما يؤدي إلى أن تصبح أنظمة تربية الأحياء المائية مصدرا مهما للبكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية والمسببة للأمراض ذات الأهمية السريرية مثل الإشريكية القولونية (E. coli). هنا ، تم توضيح مقاومة مضادات الميكروبات ، والفوعة ، وخصائص mobilome لسلالة E. coli المسببة للأمراض ، المستردة من Oreochromis spp. المستزرعة الداخلية ، من خلال تسلسل الجينوم الكامل (WGS) وفي تحليل السيليكو . تم إجراء اختبار الحساسية لمضادات الميكروبات (AST) و WGS. علاوة على ذلك ، تم تحديد المجموعة التطورية ، والنمط المصلي ، وكتابة التسلسل متعدد المواضع (MLST) ، ومقاومة مضادات الميكروبات المكتسبة ، والفوعة ، والبلازميد ، ومحتوى البروفاج باستخدام أدوات الويب المتنوعة المتاحة. أظهرت الإشريكية القولونية المعزولة فقط قابلية متوسطة للأمبيسيلين وتم وصفها بأنها سلالة ONT: H21-B1-ST40 من خلال الكتابة القائمة على WGS. على الرغم من اكتشاف جين واحد فقط مرتبط بمقاومة مضادات الميكروبات [mdf (A)] ، فقد تم تحديد العديد من الجينات المرتبطة بالفوعة (VAGs) من النمط المرضي المعوي اللانمطي للإشريكية القولونية (aEPEC). بالإضافة إلى ذلك ، تم الكشف عن شحنة من replicons البلازميد من مجموعات البلازميد الكبيرة و 18 منطقة مرتبطة بالبروفاج. وفي الختام، فإن توصيف WGS لعزلة aEPEC، التي تم استردادها من مزرعة سمكية في سينالوا، المكسيك، يسمح بإلقاء نظرة ثاقبة على إمكاناتها المسببة للأمراض والمخاطر المحتملة على صحة الإنسان لاستهلاك منتجات تربية الأحياء المائية الخام. من الضروري استغلال تقنيات تسلسل الجيل التالي (NGS) لدراسة الكائنات الحية الدقيقة البيئية واعتماد إطار صحي واحد لمعرفة كيفية نشوء القضايا الصحية.
Introduction
تعد تربية الأحياء المائية واحدة من أسرع قطاعات إنتاج الأغذية نموا في جميع أنحاء العالم ، وتهدف ممارسات إنتاجها إلى تلبية الطلب المتزايد على الغذاء للاستهلاك البشري. تضاعف الإنتاج العالمي لتربية الأحياء المائية ثلاث مرات من 34 مليون طن في عام 1997 إلى 112 مليون طن في عام 20171. كانت مجموعات الأنواع الرئيسية ، التي ساهمت في ما يقرب من 75 ٪ من الإنتاج ، هي الأعشاب البحرية ، والكارب ، وذوات الصدفتين ، وسمك السلور ، والبلطي (Oreochromis spp.) 1. ومع ذلك ، فإن ظهور الأمراض التي تسببها الكيانات الميكروبية أمر لا مفر منه بسبب الاستزراع السمكي المكثف ، مما يؤدي إلى خسائر اقتصادية محتملة2.
من المعروف جيدا استخدام المضادات الحيوية في ممارسات تربية الأسماك للوقاية من الالتهابات البكتيرية وعلاجها ، وهو العامل الرئيسي المحدد في الإنتاجية 3,4. ومع ذلك ، تتراكم المضادات الحيوية المتبقية في رواسب تربية الأحياء المائية والمياه ، مما يمارس ضغطا انتقائيا ويعدل المجتمعات البكتيرية المرتبطة بالأسماك والموجودة5،6،7،8. وبالتالي، فإن بيئة الاستزراع المائي تعمل كمستودع للجينات المقاومة لمضادات الميكروبات (ARGs)، وزيادة ظهور وانتشار البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية (ARB) في الوسط المحيط9. بالإضافة إلى مسببات الأمراض البكتيرية التي لوحظت عادة والتي تؤثر على ممارسات تربية الأسماك ، غالبا ما يصادف أفراد من عائلة Enterobacteriaceae ، بما في ذلك سلالات مسببات الأمراض البشرية من Enterobacter spp. ، والإشريكية القولونية ، و Klebsiella spp. ، والسالمونيلا spp.10. الإشريكية القولونية هي الكائنات الحية الدقيقة الأكثر شيوعا المعزولة من مسحوق السمك والماء في تربية الأسماك11،12،13،14،15.
الإشريكية القولونية هي بكتيريا سالبة الجرام متعددة الاستخدامات تعيش في الجهاز الهضمي للثدييات والطيور كعضو متعايش في الجراثيم المعوية. ومع ذلك ، تمتلك الإشريكية القولونية قدرة عالية على التكيف للاستعمار والاستمرار في منافذ بيئية مختلفة ، بما في ذلك التربة والرواسب والغذاء والماء16. بسبب اكتساب الجينات وفقدانها من خلال ظاهرة نقل الجينات الأفقية (HGT) ، تطورت الإشريكية القولونية بسرعة إلى ممرض مقاوم للمضادات الحيوية جيد التكيف ، وقادر على التسبب في مجموعة واسعة من الأمراض في البشر والحيوانات17,18. بناء على أصل العزلة ، يتم تعريف المتغيرات المسببة للأمراض على أنها الإشريكية القولونية المسببة للأمراض المعوية (InPEC) أو الإشريكية القولونية المسببة للأمراض خارج الأمعاء (ExPEC). علاوة على ذلك ، يتم تصنيف InPEC و ExPEC إلى أنماط مرضية محددة جيدا وفقا لمظاهر المرض والخلفية الجينية وسمات النمط الظاهري وعوامل الفوعة (VFs)16،17،19.
سمحت الثقافة التقليدية والتقنيات الجزيئية لسلالات الإشريكية القولونية المسببة للأمراض بالكشف السريع وتحديد الأنماط المرضية المختلفة. ومع ذلك ، فقد تستغرق وقتا طويلا وشاقة وتتطلب في كثير من الأحيان تدريبا تقنيا عاليا19. علاوة على ذلك ، لا يمكن استخدام طريقة واحدة لدراسة جميع المتغيرات المسببة للأمراض من الإشريكية القولونية بشكل موثوق بسبب تعقيد خلفيتها الجينية. حاليا ، تم التغلب على هذه العيوب مع ظهور تقنيات التسلسل عالي الإنتاجية (HTS). أدت مناهج تسلسل الجينوم الكامل (WGS) وأدوات المعلوماتية الحيوية إلى تحسين استكشاف الحمض النووي الميكروبي بتكلفة معقولة وعلى نطاق واسع ، مما يسهل التوصيف المتعمق للميكروبات في جولة واحدة ، بما في ذلك المتغيرات المسببة للأمراض ذات الصلة الوثيقة20،21،22. اعتمادا على الأسئلة البيولوجية ، يمكن استخدام العديد من أدوات المعلوماتية الحيوية والخوارزميات وقواعد البيانات لإجراء تحليل البيانات. على سبيل المثال ، إذا كان الهدف الرئيسي هو تقييم وجود ARGs و VFs والبلازميدات ، فقد تكون أدوات مثل ResFinder و VirulenceFinder و PlasmidFinder ، إلى جانب قواعد البيانات المرتبطة بها ، نقطة انطلاق جيدة. قدم Carriço et al.22 نظرة عامة مفصلة عن برامج المعلوماتية الحيوية المختلفة وقواعد البيانات ذات الصلة المطبقة لتحليل WGS الميكروبي ، من المعالجة المسبقة للبيانات الخام إلى الاستدلال التطوري.
أظهرت العديد من الدراسات الفائدة الواسعة ل WGS لاستجواب الجينوم فيما يتعلق بسمات مقاومة مضادات الميكروبات ، والإمكانات المسببة للأمراض ، وتتبع الظهور والعلاقات التطورية للمتغيرات ذات الصلة سريريا من الإشريكية القولونية التي يتم الحصول عليها من أصول متنوعة23،24،25،26 . وقد مكن النظام العالمي لتحليل الميكروبات من تحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء مقاومة النمط الظاهري لمضادات الميكروبات، بما في ذلك آليات المقاومة النادرة أو المعقدة. هذا من خلال الكشف عن متغيرات ARG المكتسبة ، أو الطفرات الجديدة في الجينات المستهدفة للأدوية ، أو مناطق المروج27,28. علاوة على ذلك ، يوفر WGS إمكانية استنتاج ملامح مقاومة مضادات الميكروبات دون الحاجة إلى معرفة مسبقة بالنمط الظاهري للمقاومة للسلالة البكتيرية29. وبدلا من ذلك، سمح الفريق العامل بتوصيف العناصر الجينية المتنقلة التي تحمل كلا من مقاومة مضادات الميكروبات وخصائص الفوعة، مما دفع تطور الجينوم البكتيري لمسببات الأمراض الموجودة. على سبيل المثال، أدى تطبيق WGS أثناء التحقيق في فاشية الإشريكية القولونية الألمانية في عام 2011 إلى الكشف عن السمات الجينومية الفريدة للنمط المرضي الجديد على ما يبدو للإشريكية القولونية. ومن المثير للاهتمام ، أن سلالات الفاشية هذه نشأت من مجموعة الإشريكية القولونية المعوية (EAEC) ، التي اكتسبت البروفاج الذي يشفر سم الشيغا من النمط المرضيالمعوي النزفي E. coli (EHEC) 30.
يقدم هذا العمل تكيفا منهجيا لسير العمل ل WGS البكتيرية باستخدام جهاز تسلسل فوق الطاولة. علاوة على ذلك ، يتم توفير خط أنابيب المعلوماتية الحيوية باستخدام أدوات قائمة على الويب لتحليل التسلسلات الناتجة ودعم الباحثين ذوي الخبرة المحدودة أو معدومة في المعلوماتية الحيوية. سمحت الطرق الموصوفة بتوضيح مقاومة مضادات الميكروبات ، والفوعة ، وخصائص mobilome لسلالة الإشريكية القولونية المسببة للأمراض ACM5 ، المعزولة في عام 2011 من Oreochromis spp. المستزرعة الداخلية في سينالوا ، المكسيك12.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم هذه الدراسة تكيفا لسير عمل WGS البكتيري باستخدام جهاز تسلسل على الطاولة وخط أنابيب للتوصيف الجيني لمتغير الإشريكية القولونية الممرض. اعتمادا على منصة التسلسل المستخدمة ، يمكن أن تختلف أوقات الاستجابة (TATs) لإجراءات المختبر الرطب (زراعة البكتيريا ، واستخراج gDNA ، وإعداد المكتبة ، و?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
إلى المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا في المكسيك (CONACyT باختصارها باللغة الإسبانية) لمنحة الدكتوراه الممنوحة لخوسيه أنطونيو ماغانيا-ليزاراغا [رقم 481143].
Materials
| Accublock Mini digital dry bath | Labnet | D0100 | Dry bath for incubation of tubes |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for DNA library purification |
| DeNovix DS-11 | DeNovix Inc. | UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 0030108418 | 1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 12321D | Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification |
| Gram-negative Multibac I.D. | Diagnostic reseach (Mexico) | PT-35 | Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing |
| MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles) | Illumina | FC-420-1004 | Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2×150) |
| MiniSeq System Instrument | Illumina | SY-420-1001 | Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing |
| MiniSpin centrifuge | Eppendorf | 5452000816 | Standard centrifuge for tubes |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 | Index set A, B, C, D |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | DNA library control for sequencing |
| Precision waterbath | LabCare America | 51221081 | Water bath shaker used for bacterial culture |
| Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Q33231 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Q32866 | Fluorometer used for fluorescence assay |
| Qubit Assay tubes | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Q32856 | 0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific | A24811 | Thermocycler used for DNA library amplification |
| Spectronic GENESYS 10 Vis | Thermo | 335900 | Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing |
| ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit | Zymo Research Inc. | D4300 | Kit for genomic DNA extraction (50 preps) |
References
- Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
- Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use of veterinary drugs: special issue for fluoroquinolones-a review. Journal of Food Science. 78 (9), 1321-1333 (2013).
- Defoirdt, T., Sorgeloos, P., Bossier, P. Alternatives to antibiotics for the control of bacterial disease in aquaculture. Current Opinion in Microbiology. 14 (3), 251-258 (2011).
- Stentiford, G. D., et al. New paradigms to help solve the global aquaculture disease crisis. PLOS Pathogens. 13 (2), 1006160 (2017).
- Chen, H., et al. Tissue distribution, bioaccumulation characteristics and health risk of antibiotics in cultured fish from a typical aquaculture area. Journal of Hazardous Materials. 343, 140-148 (2018).
- Zhou, M., et al. Antibiotics control in aquaculture requires more than antibiotic-free feeds: A Tilapia farming case. Environmental Pollution. 268, 115854 (2021).
- Feng, Y., et al. Ecological effects of antibiotics on aquaculture ecosystems based on microbial community in sediments. Ocean & Coastal Management. 224, 106173 (2022).
- Shen, X., Jin, G., Zhao, Y., Shao, X. Prevalence and distribution analysis of antibiotic resistance genes in a large-scale aquaculture environment. Science of The Total Environment. 711, 134626 (2020).
- Su, H., et al. Contamination of antibiotic resistance genes (ARGs) in a typical marine aquaculture farm: source tracking of ARGs in reared aquatic organisms. Journal of Environmental Science and Health, Part B. 55 (3), 220-229 (2020).
- Oliveira, R. V., Oliveira, M. C., Pelli, A. Disease infection by Enterobacteriaceae family in fishes: a review. Journal of Microbiology & Experimentation. 4 (5), 00128 (2017).
- Barbosa, M. M. C., et al. Sorologia e suscetibilidade antimicrobiana em isolados de Escherichia coli de pesque-pagues. Arquivos do Instituto Biológico. 81 (1), 43-48 (2014).
- Valenzuela-Armenta, J. A., et al. Microbiological analysis of Tilapia and water in aquaculture farms from Sinaloa. Biotecnia. 20 (1), 20-26 (2018).
- Reza, R. H., Shipa, S. A., Naser, M. N., Miah, M. F. Surveillance of Escherichia coli in a fish farm of Sylhet, Bangladesh. Bangladesh Journal of Zoology. 48 (2), 335-346 (2021).
- Liao, C. -. Y., et al. Antimicrobial resistance of Escherichia coli From aquaculture farms and their environment in Zhanjiang, China. Frontiers in Veterinary Science. 8, 806653 (2021).
- Dewi, R. R., et al. Prevalence and antimicrobial resistance of Escherichia coli, Salmonella and Vibrio derived from farm-raised Red Hybrid Tilapia (Oreochromis spp.) and Asian Sea Bass (Lates calcarifer, Bloch 1970) on the west coast of Peninsular Malaysia. Antibiotics. 11 (2), 136 (2022).
- Leimbach, A., Hacker, J., Dobrindt, U. E. coli as an all-rounder: the thin line between commensalism and pathogenicity. Current Topics in Microbiology and Immunology. 358, 3-32 (2013).
- Kaper, J. B., Nataro, J. P., Mobley, H. L. T. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 123-140 (2004).
- Croxen, M. A., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 26-38 (2010).
- Croxen, M. A., et al. Recent advances in understanding enteric pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 26 (4), 822-880 (2013).
- Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clinical Microbiology and Infection. 19 (9), 803-813 (2013).
- Lynch, T., Petkau, A., Knox, N., Graham, M., Van Domselaar, G. A primer on infectious disease bacterial genomics. Clinical Microbiology Reviews. 29 (4), 881-913 (2016).
- Carriço, J. A., Rossi, M., Moran-Gilad, J., Van Domselaar, G., Ramirez, M. A primer on microbial bioinformatics for nonbioinformaticians. Clinical Microbiology and Infection. 24 (4), 342-349 (2018).
- Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Draft genome sequence of Escherichia coli M51-3: a multidrug-resistant strain assigned as ST131-H30 recovered from infant diarrheal infection in Mexico. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 19, 311-312 (2019).
- Pérez-Vázquez, M., et al. Emergence of NDM-producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Spain: phylogeny, resistome, virulence and plasmids encoding blaNDM-like genes as determined by WGS. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (12), 3489-3496 (2019).
- Massella, E., et al. Snapshot study of whole genome sequences of Escherichia coli from healthy companion animals, livestock, wildlife, humans and food in Italy. Antibiotics. 9 (11), 782 (2020).
- Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Genomic profiling of antibiotic-resistant Escherichia coli isolates from surface water of agricultural drainage in north-western Mexico: detection of the international high-risk lineages ST410 and ST617. Microorganisms. 10 (3), 662 (2022).
- Saracino, I. M., et al. Next Generation sequencing for the prediction of the antibiotic resistance in Helicobacter pylori: a literature review. Antibiotics. 10 (4), 437 (2021).
- Ghosh, A., Saha, S. Survey of drug resistance associated gene mutations in Mycobacterium tuberculosis, ESKAPE and other bacterial species. Scientific Reports. 10 (1), 8957 (2020).
- Su, M., Satola, S. W., Read, T. D. Genome-based prediction of bacterial antibiotic resistance. Journal of Clinical Microbiology. 57 (3), 01405-01418 (2019).
- Brzuszkiewicz, E., et al. Genome sequence analyses of two isolates from the recent Escherichia coli outbreak in Germany reveal the emergence of a new pathotype: Entero-Aggregative-Haemorrhagic Escherichia coli (EAHEC). Archives of Microbiology. 193 (12), 883-891 (2011).
- . CLSI Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 13th ed. CLSI standard M02. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m02/ (2018)
- CLSI Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 31st ed. CLSI supplement M100. Clinical and Laboratory Standards Institute Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100/ (2021)
- Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
- Quainoo, S., et al. Whole-genome sequencing of bacterial pathogens: the future of nosocomial outbreak analysis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (4), 1015-1063 (2017).
- Desai, A., et al. Identification of optimum sequencing depth especially for de novo genome assembly of small genomes using next generation sequencing data. PLoS ONE. 8 (4), 60204 (2013).
- Nishino, K., Yamada, J., Hirakawa, H., Hirata, T., Yamaguchi, A. Roles of TolC-dependent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to β-lactams. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 3030-3033 (2003).
- Li, M., et al. The resistance mechanism of Escherichia coli induced by ampicillin in laboratory. Infection and Drug Resistance. 12, 2853-2863 (2019).
- Ménard, L. -. P., Dubreuil, J. D. Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1 (EAST1): a new toxin with an old twist. Critical Reviews in Microbiology. 28 (1), 43-60 (2002).
- Dubreuil, J. D. EAST1 toxin: An enigmatic molecule associated with sporadic episodes of diarrhea in humans and animals. Journal of Microbiology. 57 (7), 541-549 (2019).
- Goldstein, S., Beka, L., Graf, J., Klassen, J. L. Evaluation of strategies for the assembly of diverse bacterial genomes using MinION long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 23 (2019).
- Guerrero, A., Gomez-Gil, B., Lizarraga-Partida, M. L. Genomic stability among O3:K6 V. parahaemolyticus pandemic strains isolated between 1996 to 2012 in American countries. BMC Genomic Data. 22 (1), 38 (2021).
- FAO Applications of Whole Genome Sequencing (WGS) in food safety management. Food and Agriculture Organization of the United Nations Available from: https://www.fao.org/documents/card/es/c/61e44b34-b328-4239-b59c-a9e926e327b4/ (2016)
- Rantsiou, K., et al. Next generation microbiological risk assessment: opportunities of whole genome sequencing (WGS) for foodborne pathogen surveillance, source tracking and risk assessment. International Journal of Food Microbiology. 287, 3-9 (2018).
