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遗传学

オレオクロミス属由来の病原性大腸菌株のキャラクタリゼーション 全ゲノムシーケンシングを使用する農場

Published: December 23, 2022
doi:
10.3791/64404
, , ,
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas,Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD),Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

Summary

ベンチトップ機器を使用した全ゲノムシーケンス(WGS)戦略の実現可能性により、ラボ環境での公衆衛生に関連するすべての微生物のゲノム調査が簡素化されました。細菌WGSのワークフローの方法論的適応について説明し、分析のためのバイオインフォマティクスパイプラインも提示します。

Abstract

水産養殖は世界で最も急速に成長している食料生産部門の1つであり、ティラピア(オレオクロミス属)養殖は養殖される主要な淡水魚の品種を構成しています。水産養殖は人為的発生源に由来する微生物汚染の影響を受けやすいため、抗生物質の広範な使用が必要であり、養殖システムは、大腸菌(大腸菌)などの抗生物質耐性菌および病原性細菌の重要な発生源になります。ここでは、内陸養殖オレオクロミス属から回収された病原性大腸菌株の抗菌剤耐性、病原性、およびモビロームの特徴を、全ゲノムシーケンス(WGS)およびインシリコ分析によって解明しました。抗菌薬感受性試験(AST)およびWGSを実施した。さらに、系統発生グループ、血清型、多遺伝子座配列タイピング(MLST)、獲得された抗菌剤耐性、病原性、プラスミド、およびプロファージ含有量を、利用可能な多様なWebツールを使用して決定しました。大腸菌分離株はアンピシリンに対する中程度の感受性のみを示し、WGSベースのタイピングによってONT:H21-B1-ST40株として特徴付けられました。単一の抗菌薬耐性関連遺伝子のみが検出されたが[mdf(A)]、非定型腸病原性大腸菌(aEPEC)病型からのいくつかの病原性関連遺伝子(VAG)が同定された。さらに、大きなプラスミドグループと18のプロファージ関連領域からのプラスミドレプリコンの貨物が検出されました。結論として、メキシコのシナロア州の養魚場から回収されたaEPEC分離株のWGS特性評価は、その病原性の可能性と生の水産養殖製品を消費することによる人間の健康リスクの可能性についての洞察を可能にします。環境微生物を研究するための次世代シーケンシング(NGS)技術を活用し、健康問題がどのように発生するかを知るためにワンヘルスフレームワークを採用する必要があります。

Introduction

水産養殖は、世界で最も急速に成長している食料生産部門の1つであり、その生産慣行は、人間の消費に対する増大する食料需要を満たすことを目的としています。世界の養殖生産量は、1997年の3,400万トン(Mt)から2017年には112Mtに3倍になりました1。生産の75%近くに貢献している主な種グループは、海藻、コイ、二枚貝、ナマズ、ティラピア(オレオクロミス 属)でした。1. しかし、微生物主体による病気の出現は、集中的な養殖のために避けられず、潜在的な経済的損失につながる2.

魚の養殖慣行における抗生物質の使用は、生産性の主な制限要因である細菌感染の予防と治療でよく知られています3,4。それにもかかわらず、残留抗生物質は水産養殖の堆積物と水に蓄積し、選択圧を発揮し、魚に関連する細菌群集と存在する細菌群集を改変します5,6,7,8。その結果、水産養殖環境は抗菌薬耐性遺伝子(ARG)の貯蔵庫として機能し、周囲の環境で抗生物質耐性菌(ARB)がさらに出現および拡散します9。魚の養殖慣行に影響を与える一般的に観察される細菌性病原体に加えて、エンテロバクター属、大腸菌、クレブシエラ属、サルモネラ属菌のヒト病原体株を含む腸内細菌科のメンバーにしばしば遭遇します10。大腸菌は、魚の養殖において魚粉と水から分離された最も一般的な微生物です11、12、13、14、15。

大腸菌は、哺乳類や鳥類の腸内細菌叢の共生メンバーとして胃腸管に生息する多用途のグラム陰性菌です。しかし、大腸菌は、土壌、堆積物、食物、水など、さまざまな環境ニッチにコロニーを形成し、存続する適応性の高い能力を持っています16。遺伝子水平伝播(HGT)現象による遺伝子の増減により、大腸菌は急速に適応した抗生物質耐性病原体に進化し、ヒトおよび動物に広範囲の疾患を引き起こす可能性があります17,18。単離起源に基づいて、病原性変異体は、腸病原性大腸菌(InPEC)または腸外病原性大腸菌(ExPEC)として定義される。さらに、InPECとExPECは、疾患の発現、遺伝的背景、表現型形質、および病原性因子(VF)に従って明確に定義された病理型に細分化されます16,17,19。

病原性大腸菌株の伝統的な培養と分子技術により、さまざまな病型の迅速な検出と同定が可能になりました。ただし、それらは時間と手間がかかり、多くの場合、高度な技術トレーニングが必要になる場合があります19。さらに、大腸菌のすべての病原性多様体は、その遺伝的背景が複雑なため、単一の方法を使用して確実に研究することはできません。現在、これらの欠点は、ハイスループットシーケンシング(HTS)技術の出現によって克服されています。全ゲノムシーケンシング(WGS)アプローチとバイオインフォマティクスツールは、微生物DNAの探索を手頃な価格で大規模に改善し、密接に関連する病原性多様体を含む微生物の詳細な特性評価を1回の実行で容易にしました20,21,22。生物学的な質問に応じて、いくつかのバイオインフォマティクスツール、アルゴリズム、およびデータベースを使用してデータ分析を実行できます。たとえば、主な目標がARG、VF、およびプラスミドの存在を評価することである場合、ResFinder、VirulenceFinder、PlasmidFinderなどのツールと、それらに関連するデータベースが適切な出発点になる可能性があります。Carriço et al.22は、生データの前処理から系統発生的推論まで、微生物WGS分析に適用されるさまざまなバイオインフォマティクスソフトウェアと関連データベースの詳細な概要を提供しました。

いくつかの研究は、抗菌薬耐性属性、病原性の可能性、および多様な起源に由来する大腸菌の臨床的に関連する変異体の出現と進化的関係の追跡に関するゲノム調査のためのWGSの幅広い有用性を実証しています23,24,25,26.WGSは、希少または複雑な耐性メカニズムを含む、抗菌剤に対する表現型耐性の根底にある分子メカニズムの同定を可能にしました。これは、獲得されたARG変異体、薬物標的遺伝子における新規変異、またはプロモーター領域27、28を検出することによるものである。さらに、WGSは、細菌株の耐性表現型に関する事前知識を必要とせずに抗菌剤耐性プロファイルを推測する可能性を提供する29。あるいは、WGSは、抗菌剤耐性と病原性の特徴の両方を持つ可動遺伝要素(MGE)の特性評価を可能にし、既存の病原体の細菌ゲノム進化を推進してきました。たとえば、2011年のドイツの大腸菌発生の調査中にWGSを適用した結果、明らかに新しい大腸菌の病理型のユニークなゲノム特徴が明らかになりました。興味深いことに、これらのアウトブレイク株は、腸管出血性大腸菌(EHEC)の病型30から志賀毒素をコードするプロファージを獲得した腸凝集性大腸菌(EAEC)グループに由来します。

この研究は、ベンチトップシーケンサーを使用した細菌WGSのワークフローの方法論的適応を示しています。さらに、Webベースのツールを使用してバイオインフォマティクスパイプラインが提供され、結果の配列を分析し、バイオインフォマティクスの専門知識が限られているかまったくない研究者をさらにサポートします。記載された方法により、2011年にメキシコのシナロア州で内陸養殖オレオクロミス属から単離された病原性大腸菌ACM5株の抗菌剤耐性、病原性、およびモビロームの特徴を解明することができました12。

Protocol

注:大腸 菌 株ACM5は、糞便性大腸菌群(FC)測定のために魚サンプルを処理および培養することによって回収されました12。魚のサンプリング中、魚は病気、細菌、または真菌感染の臨床的兆候を示さず、平均温度は22.3°Cでした。単離後、 大腸菌 分離物を生化学的試験にかけ、凍結保護剤としてDMSO(8%v/v)を含む脳心臓注入(BHI)ブロスで凍結保存しました。 <p class=…

Representative Results

抗菌薬感受性はディスク拡散法によって決定され、6つの異なる抗菌クラス、すなわちアミノグリコシド、βラクタム、フルオロキノロン、ニトロフラン、フェニコール、および葉酸経路アンタゴニストにまたがる12の抗生物質のCLSIブレークポイント基準によって解釈されました。 大腸菌 ACM5は、1つのβラクタム薬を除くすべての抗生物質に対して感受性を示しました。4つのβラクタム?…

Discussion

この研究は、病原性 大腸菌 変異体のゲノム特性評価のためのベンチトップシーケンサーとパイプラインを使用した細菌WGSワークフローの適応を示しています。使用するシーケンシングプラットフォームに応じて、特に増殖の遅い細菌を研究する場合、ウェットラボ手順(細菌培養、gDNA抽出、ライブラリ調製、シーケンシング)およびシーケンス分析のターンアラウンドタイム(TAB)は異な…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ホセアントニオマガーニャリサラガ[No.481143]に授与された博士奨学金のために、メキシコ国立科学技術評議会(スペイン語の頭字語でCONACyT)に。

Materials

Accublock Mini digital dry bath Labnet D0100 Dry bath for incubation of tubes
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 Magnetic beads in solution for DNA library purification
DeNovix DS-11 DeNovix Inc. UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted
DNA LoBind Tubes Eppendorf 0030108418 1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling
DynaMag-2 Magnet Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 12321D Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification
Gram-negative Multibac I.D. Diagnostic reseach (Mexico) PT-35 Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles) Illumina FC-420-1004 Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2×150)
MiniSeq System Instrument Illumina SY-420-1001 Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing
MiniSpin centrifuge Eppendorf 5452000816 Standard centrifuge for tubes
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1024 Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples
Nextera XT Index Kit v2 Illumina FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 Index set A, B, C, D
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001 DNA library control for sequencing
Precision waterbath LabCare America 51221081 Water bath shaker used for bacterial culture
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q33231 Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32866 Fluorometer used for fluorescence assay 
Qubit Assay tubes Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32856 0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay 
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific A24811 Thermocycler used for DNA library amplification
Spectronic GENESYS 10 Vis Thermo 335900 Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit Zymo Research Inc. D4300 Kit for genomic DNA extraction (50 preps)
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References

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Magaña-Lizárraga, J. A., Gómez-Gil, B., Enciso-Ibarra, J., Báez-Flores, M. E. Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. J. Vis. Exp. (190), e64404, doi:10.3791/64404 (2022).
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