Summary

Anofellerde Plasmodium falciparum Enfeksiyonunun Tespiti için Standart Membran Besleme Testi

Published: May 12, 2022
doi:

Summary

Standart membran besleme testi (SMFA), potansiyel sıtma önleyici bileşiklerin değerlendirilmesi ve tanımlanması için altın standart olarak kabul edilir. Bu yapay besleme sistemi, bu tür bileşiklerin Plasmodium falciparum parazitinin yoğunluğu ve prevalansı üzerindeki etkilerini daha fazla değerlendirmek için sivrisinekleri enfekte etmek için kullanılır.

Abstract

Sıtma, dünya çapında en yıkıcı hastalıklardan biri olmaya devam etmektedir ve bugüne kadar, Afrika bölgesi hala dünya çapındaki tüm vakaların% 94’ünden sorumludur. Bu paraziter hastalık bir protozoan parazit, bir Anopheles sivrisinek vektörü ve bir omurgalı konakçı gerektirir. Anopheles cinsi, 60’ı parazitin vektörleri olarak bilinen 500’den fazla türden oluşur. Plasmodium parazit cinsi 250 türden oluşur ve bunların 48’i hastalık bulaşmasında rol oynar. Ayrıca, Plasmodium falciparum paraziti, son yıllarda Sahra altı Afrika’daki sıtma vakalarının tahmini% 99.7’sine katkıda bulunmuştur.

Gametositler, parazitin cinsel aşamasının bir parçasını oluşturur ve enfekte bir insan konakçısı üzerinde beslendikten sonra dişi sivrisinek tarafından yutulur. Parazitin sivrisinek içindeki daha da gelişmesi, sivrisineğin orta bağırsağındaki elverişli çevresel koşullarla arttırılır. Burada, dişi ve erkek gametlerin kaynaşması gerçekleşir ve hareketli ookinetler ortaya çıkar. Ookinetes, sivrisineğin midgut epiteline girer ve olgun ookinetes, sırayla hareketli sporozoitler üreten ookistler oluşturur. Bu sporozoitler sivrisineğin tükürük bezlerine göç eder ve bir sivrisinek kan unu alırken enjekte edilir.

İlaç keşfi amacıyla, sivrisinekler standart membran besleme testinde (SMFA) gametosit ile enfekte olmuş kan ile yapay olarak enfekte edildi. Sivrisinek içindeki enfeksiyonu tespit etmek ve / veya sıtma önleyici bileşiklerin etkinliğini değerlendirmek için, dişi sivrisineklerin orta bağırsakları enfeksiyon sonrası çıkarıldı ve merkürokrom ile boyandı. Bu yöntem, ookist prevalansının ve yoğunluğunun doğru belirlenmesi için mikroskop altında ookistlerin görsel tespitini arttırmak için kullanıldı.

Introduction

Dünya çapında en yıkıcı hastalıklardan biri olarak bilinen sıtma, birçok ülkeye, özellikle de Afrika bölgesindekilere hala büyük bir tehdit oluşturmaktadır ve dünya çapındaki vakaların yaklaşık% 95’ine katkıda bulunmaktadır1. Bu hastalığa bir protozoan parazit neden olur ve Anopheles sivrisinek vektörü ile birlikte, bu suçlular insan konakçısına büyük zarar verebilir2. Daha spesifik olarak, Plasmodium parazit cinsinin falciparum türleri, Sahra altı Afrika’daki sıtma vakalarının tahmini% 99’undan sorumludur1. Buna ek olarak, birkaç büyük Anopheles sivrisinek vektörü (An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n. ve An. funestus Giles dahil) küresel olarak parazit iletiminin% 95’inden fazlası için suçlanabilir 3,4,5,6,7,8 . İdeal parazit-vektör arkadaşlığının kurulması için, sivrisinek vektörünün parazite duyarlı olması veonu 9 iletebilmeli olmalıdır. Ayrıca, hem vektör hem de parazit, mükemmel enfektif kombinasyonu oluşturmak için fiziksel engellerin üstesinden gelmelidir – sivrisinek vektörü parazit gelişimini sürdürebilmeli ve parazit, konağın savunma mekanizmalarının üstesinden gelme yeteneğine sahip olmalıdır10,11.

P. falciparum parazitinin cinsel aşaması olan gametositler, vektör ve parazit partnerlerinin birbirine bağlanmasında çok önemli bir rol oynar12. Cinsel gelişim in vivo olarak gerçekleşir ve gametositogenez, olgun gametositlerin hareketli erkek mikrogametlere ve dişi makrogametlere farklılaşma sürecini tanımlar13. Sivrisinek içinde gerçekleşen bir başka süreç de kamçılanmadır – erkek gametositin gametlere dönüştüğü ve bir kan yemeği sırasında alınan kırmızı kan hücrelerinden çıktığı süreç11. Eksflagellasyon sürecinin, sivrisinek midgut14’ün ortamındaki olumlu bir değişiklikle arttırılması önerilmektedir. Eksflagellasyondan sonra, erkek ve dişi gametlerin kaynaşmasıyla bir zigot oluşur13. Zigottan, hareketli bir ookinete ortaya çıkar ve kan unundan sivrisinek midgut13’ün epiteline doğru hareket eder. Burada, ookinete olgunlaşır ve sırayla hareketli sporozoitler13,15 üreten bir ookist oluşur. Sporozoitler daha sonra sivrisinek tükürük bezlerine göç eder ve sivrisinek konakçısından bir kan unu aldığından, bu sporozoitler konağın kan dolaşımına enjekte edilir15.

Vektör kontrol stratejileri ile etkili sıtma önleyici ilaçların kullanımını birleştiren sıtma kontrol müdahaleleri, bu hastalıkla mücadelede çok önemli hale gelmiştir15. Parazit ve sivrisinek direncindeki artışla birlikte, yeni sıtma önleyici bileşiklerin tanımlanması için aciliyetartmaktadır 16. Bu nedenle, iletimi bloke eden bileşiklerin in vivo değerlendirilmesi önemlidir16. Bu tür etkili bulaşmayı engelleyen ilaçların geliştirilmesinden sonra, SMFA, bu bileşiklerin Anopheles sivrisinek17,18,19’daki P. falciparum’un cinsel gelişimini inhibe edip etmediğini değerlendirmek için kullanılmıştır. Bu tahlil, 1970-1980’lerden bu yana, iletim blokajı 20,21’i değerlendirmek için altın standart olarak tanınmıştır. Bu tahlil, özel ekipman gerektiren RT-qPCR gibi diğer tahlillerden daha ucuz bir alternatif sunar. Ayrıca, deneyleri yürütmek için hiçbir hastaya gerek yoktur. Bu tahlil aynı zamanda dişi sivrisineklere gametosit kaynaklı kanın sağlanmasını da içerir, bunlar daha sonra ookist gelişiminin mevcut olup olmadığını değerlendirmek için disseke edilir21. Bu, gametosit miktarının belirlenmesine ve bileşikler22 nedeniyle deforme olmuş ookistlerin tespit edilmesine izin verir. Bir bileşiğin etkili olarak sınıflandırılması için, enfeksiyon inhibisyonunu değerlendirmek için prevalansı (midgutta en az bir ookist barındıran sivrisineklerin oranı) ve sivrisinek midgutundaki ookist sayısı (yoğunluk) değerlendirilmelidir 17,21,22.

Protocol

Protokolün bir örneği için Şekil 1’e bakın. İnsan kanının geri çekilmesi ve kullanılması için Pretoria Üniversitesi Sağlık Bilimleri Etik Kurulu’ndan (506/2018) etik izin alınmıştır. 1. Gametosit kültürü NOT: SMFA’yı kurmadan önce, Pretoria Üniversitesi’nde bir gametosit kültürü hazırlanmıştır (protokolün tamamı için Reader ve ark.22’ye bakınız). NF…

Representative Results

Diseke edilen toplam kontrol örneği sayısı 47 olup, ortalama prevalansı ve midgut başına 9.5 ookist yoğunluğu saptanmıştır (Tablo 1, daha önce yayınlandığı gibi22). MMV1581558 bileşiği için, örneklem büyüklüğü% 36 ookist prevalansı ve ortalama 1.5 ookist yoğunluğu ile toplam 42 örneğe ulaştı. Bu, her üç biyolojik replikantta da ookist prevalansında% 58’lik bir azalma ve% 82’lik bir TRA olduğunu göstermektedir (Tablo 1).</p…

Discussion

Bu protokolün başarılı bir şekilde yürütülebilmesi için, sıkıcı ve zahmetli bir süreç olsa bile, her adıma dikkat edilmelidir. En önemli adımlardan biri, SMFA23,24’e başlamadan önce gametosit kültürünün kaliteli olmasını ve doğru erkek:kadın oranına sahip olgun gametositlerden oluşmasını sağlamaktır. SMFA sırasında, erkek gametlerin sivrisineğe girmeden önce patlamasını önlemek için gametosit kültürünü doğru sıcaklı…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar teşekkür ederProf. Pretoria Üniversitesi Biyokimya, Genetik ve Mikrobiyoloji Bölümü’nden Lyn-Mari Birkholtz ve Dr. Janette Reader, gametosit kültürünün kültürlenmesi ve tedarik edilmesi için Pretoria Üniversitesi Sürdürülebilir Sıtma Kontrolü Enstitüsü. Parazit suşu ikinci bölümden elde edildi (bu yayının bir parçası değil). Bilim ve İnovasyon Bölümü (DSI) ve Ulusal Araştırma Vakfı (NMG); Güney Afrika Araştırma Başkanları Girişimi (UID 64763’ten LK’ya ve UID 84627’den LMB’ye); NMG Uygulama Toplulukları (UID 110666 LMB ve LK’ya); ve Güney Afrika Tıbbi Araştırma Konseyi Stratejik Sağlık İnovasyon Ortaklıkları (SHIP) da DSI’dan gelen fonlar için kabul edilmektedir.

Materials

Bovine intestine/ Butchery
Compound MMV1581558 MMV Pandemic response box
Dissecting needles WRIM Custom made
falcon tube Lasec
Glass feeders Glastechniek Peter Coelen B.V.
Graphpad Prism (8.3.0) Graphpad
Mercurochrome Merck (Sigma-Aldrich) 129-16-8
Microscope slides Merch (Sigma-Aldrich) S8902
Parafilm Cleansafe
PBS tablets ThermoFisher Scientific BP2944
Perspex biosafety cabinet Wits University Made by the contractors at Wits
Plastic cups (350 mL) Plastic Land

References

  1. World Malaria Report. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240040496 (2021)
  2. Takken, W., Verhulst, N. O. Host preferences of blood feeding mosquitoes. Annual Review of Entomology. 58, 433-453 (2013).
  3. Gillies, M. T., Coetzee, M. Supplement to the Anophelinae of Africa south of the Sahara Afrotropical region. Publications of the South African Institute for Medical Research. 55, 1 (1987).
  4. Gillies, M. T., De Meillon, B. The Anophelinae of Africa south of the Sahara. Publications of the South African Institute for Medical Research. 54, (1968).
  5. Antonio-Nkondjio, C., et al. Complexity of the malaria vectorial system in Cameroon: contribution of secondary vectors to malaria transmission. Journal of Medical Entomology. 43, 1215-1221 (2006).
  6. Sinka, M. E., et al. The dominant Anopheles vectors of human malaria in Africa, Europe and the Middle East: occurrence data, distribution maps and bionomic précis. Parasites and Vectors. 3, 117 (2010).
  7. Coetzee, M., Hunt, R. H., Wilkerson, R., Della Torre, A., Coulibaly, M. B., Besansky, N. J. Anopheles coluzzii and Anopheles amharicus, new members of the Anopheles gambiae complex. Zootaxa. 3619, 246-274 (2013).
  8. Kyalo, D., Amratia, P., Mundia, C. W., Mbogo, C. M., Coetzee, M., Snow, R. W. A geo-coded inventory of anophelines in the Afrotropical Region south of the Sahara: 1898-2016. Wellcome Open Research. 2, 57 (2017).
  9. Cohuet, A., Harris, C., Robert, V., Fontenille, D. Evolutionary forces on Anopheles: What makes a malaria vector. Trends in Parasitology. 309, (2009).
  10. Weathersby, A. B. The role of the stomach wall in the exogenous development of Plasmodium gallinaceum as studies by means of haemocoel injections of susceptible and refractory mosquitoes. The Journal of Infectious Diseases. 91, 198-205 (1952).
  11. Ally, A. S. I., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. I. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. The Annual Review of Microbiology. 63, 195-221 (2009).
  12. Delves, M. J., et al. Male and female Plasmodium falciparum mature gametocytes show different responses to antimalarial drugs. American Society for Microbiology Journal. , (2013).
  13. Sinden, R. E. Sexual development of malarial parasites in their mosquito vector. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 75, (1981).
  14. Garcia, G. E., Wirtz, R. A., Barr, J. R., Woolfitt, A. Xanthurenic acid induces gametogenesis in Plasmodium, the malaria parasite. Journal of Biological Chemistry. 15, 12003-12005 (1998).
  15. Oaks, S. C., Mitchell, V. S., Pearson, G. W., et al. . Malaria: Obstacles and Opportunities. , (1991).
  16. Le Manach, C., et al. Identification and profiling of a novel Diazaspirol[3.4]octane chemical series active against multiple stages of the human malaria parasite Plasmodium falciparum and optimization efforts. Journal of Medicinal Chemistry. 64, 2291-2309 (2021).
  17. Cibulskis, R. E., et al. Malaria: global progress 2000-2015 and future challenges. Infect Diseases of Poverty. 5, 61 (2016).
  18. Smith, T. A., Chitnis, N., Briet, O. J., Tanner, M. Uses of mosquito-stage transmission-blocking vaccines against Plasmodium falciparum. Trends in Parasitology. 27, 190-196 (2011).
  19. Boyd, M. F., Boyd, M. F. Epidemiology: factors related to the definitive host. Malariology. , 608-697 (1949).
  20. Ponnudurai, T., van Gemert, G. J., Bensink, T., Lensen, A. H., Meuwissen, J. H. Transmission blockade of Plasmodium falciparum: its variability with gametocyte numbers and concentration of antibody. Transactions of The Royal Society of Tropical Medicine. 81, 491-493 (1987).
  21. Rutledge, L. C., Ward, R. A., Gould, D. J. Studies on the feeding response of mosquitoes to nutritive solutions in a new membrane feeder. Mosquito News. 24 (4), (1964).
  22. Reader, J., et al. Multistage and transmission-blocking targeted antimalarials discovered from the open-source MMV Pandemic Response Box. Nature Communications. 12, 269 (2021).
  23. Bousema, T., et al. Mosquito feeding assays for natural infections. PLoS One. 7 (8), (2012).
  24. Churcher, T., et al. Measuring the blockade of malaria transmission – An analysis of the standard membrane feeding assay. International Journal for Parasitology. 42, 1037-1044 (2012).
  25. Medley, G. F., et al. Heterogeneity in patterns of malarial oocyst infections in the mosquito vector. Parasitology. 106, 441-449 (1993).
  26. Miura, K., et al. Transmission-blocking activity is determined by transmission reducing activity and number of control oocysts in Plasmodium falciparum standard membrane-feeding assay. Vaccine. 34, 4145-4151 (2016).
  27. Sattabongkot, J., Maneechai, N., Rosenberg, R. Plasmodium vivax: gametocyte infectivity of naturally infected Thai adults. Parasitology. 102 (01), 27-31 (1991).
  28. Vallejo, A. F., Garcia, J., Amado-Garavito, A. B., Arevalo-Herrera, M., Herrera, S. Plasmodium vivax gametocyte infectivity in sub-microscopic infections. Malaria Journal. 15 (1), 48 (2016).
  29. Ponnudurai, T., Lensen, A. H. W., van Gemert, G. J. A., Bolmer, M. G., Meuwissen, J. H. E. Feeding behavior and sporozoite ejection by infected Anopheles stephensi. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 85, 175-180 (1991).
  30. Miura, K., et al. Qualification of standard membrane-feeding assay with Plasmodium falciparum malaria and potential improvements for future assays. PLoS One. 8, 57909 (2013).
  31. Griffin, P., et al. Safety and reproducibility of a clinical trial system using induced blood stage Plasmodium vivax infection and its potential as a model to evaluate malaria transmission. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10, 0005139 (2016).
  32. Delves, M. J., Sinden, R. E. A semi-automated method for counting fluorescent malaria oocysts increases the throughput of transmission blocking studies. Malaria Journal. 9, 35 (2010).
  33. vander Kolk, M., et al. Evaluation of the standard membrane feeding assay (SMFA) for the determination of malaria transmission-reducing activity using empirical data. Parasitology. 130, 13-22 (2005).
  34. van der Kolk, M., de Vlas, S. J., Sauerwein, R. W. Reduction and enhancement of Plasmodium falciparum transmission by endemic human sera. International Journal for Parasitology. 36, 1091-1095 (2006).
  35. Singh, M., et al. Plasmodium’s journey through the Anopheles mosquito: A comprehensive review. Biochimie. 181, 176-190 (2021).
  36. Vos, M. W., et al. A semi-automated luminescence based standard membrane feeding assay identifies novel small molecules that inhibit transmission of malaria parasites by mosquitoes. Scientific Reports. 5, 18704 (2015).
  37. Azevedo, R., et al. Bioluminescence method for in vitro screening of Plasmodium transmission-blocking compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61, (2017).
  38. Okell, L. C., Bousema, T., Griffin, J. T., Ouedraogo, A. L., Ghani, A. C., Drakeley, C. J. Factors determining the occurrence of submicroscopic malaria infections and their relevance for control. Nature Communications. 3, 1237 (2012).
  39. Pasay, C. J., et al. Piperaquine monotherapy of drug-susceptible Plasmodium falciparum infection results in rapid clearance of parasitemia but is followed by the appearance of gametocytemia. The Journal of Infectious Diseases. 214, 105-113 (2016).
  40. Stone, W. J., et al. A scalable assessment of Plasmodium falciparum transmission in the standard membrane-feeding assay, using transgenic parasites expressing green fluorescent protein-luciferase. The Journal of Infectious Diseases. 210, 1456-1463 (2014).
  41. Hasan, A. U., et al. Implementation of a novel PCR based method for detecting malaria parasites from naturally infected mosquitoes in Papua New Guinea. Malaria Journal. 8, 182 (2009).
  42. Stone, W. J., et al. The relevance and applicability of oocyst prevalence as a read-out for mosquito feeding assays. Scientific Reports. 3, 3418 (2013).
  43. Marquart, L., Baker, M., O’Rourke, P., McCarthy, J. S. Evaluating the pharmacodynamic effect of antimalarial drugs in clinical trials by quantitative PCR. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59, 4249-4259 (2015).
  44. McCarthy, J. S., et al. tolerability, pharmacokinetics, and activity of the novel long-acting antimalarial DSM265: a two-part first-in-human phase 1a/1b randomised study. TheLancet Infectious Diseases. 17, 626-635 (2017).

Play Video

Cite This Article
Erlank, E., Venter, N., Koekemoer, L. L. Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors. J. Vis. Exp. (183), e63546, doi:10.3791/63546 (2022).

View Video