Summary

ハマダラカ媒介動物における熱帯熱マラリア原虫感染の検出のための標準的な膜摂食アッセイ

Published: May 12, 2022
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Summary

標準的な膜供給アッセイ(SMFA)は、潜在的な抗マラリア化合物の評価と同定のためのゴールドスタンダードと見なされています。この人工給餌システムは、熱帯 マラリア原虫の強度と有病率に対するそのような化合物の影響をさらに評価するために蚊に感染するために使用されます。

Abstract

マラリアは依然として世界で最も壊滅的な病気の1つであり、今日まで、アフリカ地域は依然として世界の全症例の94%を占めています。この寄生虫症には、原虫寄生虫、 ハマダラカ の蚊媒介動物、および脊椎動物の宿主が必要です。 ハマダラカ 属は500種以上で構成され、そのうち60種は寄生虫のベクターとして知られています。 マラリア 原虫属は250種で構成され、そのうち48種が病気の伝染に関与しています。さらに、熱帯 マラリア原虫は、近年、サハラ以南のアフリカにおけるマラリア症例の推定99.7%に貢献しています。

配偶子細胞は寄生虫の性段階の一部を形成し、感染したヒト宿主に摂食すると雌の蚊によって摂取される。蚊内の寄生虫のさらなる発達は、蚊の中腸内の好ましい環境条件によって促進される。ここでは、女性と男性の配偶子の融合が起こり、運動性のオキネテスが始まります。オキネテスは蚊の中腸上皮に入り、成熟したオキネテスはオーシストを形成し、それが次に運動性スポロゾイトを生成します。これらのスポロゾイトは蚊の唾液腺に移動し、蚊が血の食事をとるときに注射されます。

創薬目的で、蚊は標準的な膜摂食アッセイ(SMFA)で配偶子細胞に感染した血液に人工的に感染しました。蚊の感染を検出するため、および/または抗マラリア化合物の有効性を評価するために、雌の蚊の中腸を感染後に除去し、マーキュロクロムで染色しました。この方法は、オーシストの有病率と強度を正確に決定するために、顕微鏡下でのオーシストの視覚的検出を強化するために使用されました。

Introduction

世界で最も破壊的な病気の1つとして知られているマラリアは、依然としていくつかの国、特にアフリカ地域内の国に大きな脅威をもたらし、世界中の症例の約95%を占めています1。この病気は原虫寄生虫によって引き起こされ、そのハマダラカの蚊媒介動物と一緒に、これらの犯人は人間の宿主に大きな害を及ぼす可能性があります2。より具体的には、熱帯熱マラリア原虫属の熱帯熱マラリア種は、サハラ以南のアフリカのマラリア症例の推定99%を占めています1。これに加えて、いくつかの主要なハマダラカ媒介動物(An. gambiae Giles、An. arabiensis Patton、An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n.、An. funestus Gilesを含む)は、世界の寄生虫伝播の95%以上が原因である可能性があります3,4,5,6,7,8。.理想的な寄生虫とベクターの交際が確立されるためには、蚊のベクターは寄生虫の影響を受けやすく、それを伝達できる必要があります9。さらに、ベクターと寄生虫の両方が物理的な障壁を克服して完全な感染の組み合わせを形成する必要があります-蚊のベクターは寄生虫の発生を維持できる必要があり、寄生虫は宿主の防御メカニズムを克服する能力を持っている必要があります10,11

熱帯熱マラリア原虫の性段階である配偶子細胞は、ベクターと寄生虫のパートナーをつなぐ上で重要な役割を果たします12。性的発達はin vivoで起こり、配偶子細胞形成は成熟配偶子細胞が運動性の雄性微小配偶子および雌性大配偶子に分化する過程を説明する13。蚊の中で起こる別のプロセスは、鞭打ちです-その間に雄の配偶細胞が配偶子に変化し、血の食事の間に取り込まれた赤血球から出現するプロセス11。この榴散プロセスは、蚊の中腸14の環境の好ましい変化によって増強されることがさらに示唆される。鞭毛後、接合子は男性と女性の配偶子の融合によって形成されます13。接合子から、運動性のオキネテが発生し、血粉から蚊の中腸13の上皮に移動する。ここで、オキネテが成熟し、オーシストが形成され、それが次に運動性スポロゾイトを生成する13,15。その後、スポロゾイトは蚊の唾液腺に移動し、蚊が宿主から血の食事を奪うと、これらのスポロゾイトは宿主の血流に注入されます15

ベクター制御戦略と効果的な抗マラリア薬の使用を組み合わせたマラリア制御介入は、この病気と戦う上で重要になっています15。寄生虫および蚊の抵抗性の増加に伴い、新規抗マラリア化合物の同定の緊急性が高まっています16。したがって、透過遮断化合物のin vivo評価には重要である16。このような効果的な伝達遮断薬の開発後、SMFAは、これらの化合物がハマダラカの熱帯熱マラリア原虫の性的発達を阻害するかどうかを評価するために使用されてきました17,18,19。このアッセイは、1970〜1980年代から、透過遮断を評価するためのゴールドスタンダードとして認識されています20,21。このアッセイは、特殊な装置を必要とするRT-qPCRなどの他のアッセイよりも安価な代替手段を提供します。さらに、実験を実行するために患者は必要ありません。このアッセイはまた、配偶子細胞誘導血液を雌の蚊に供給することを含み、次いで、オーシスト発生が存在するかどうかを評価するために解剖される21。これにより、配偶子細胞の定量および化合物22のために変形したオーシストの検出が可能になります。化合物が有効であると分類されるためには、感染阻害を評価するために、蚊の中腸における有病率(少なくとも1つのオーシストを保有する蚊の割合)および蚊の中腸におけるオーシストの数(強度)を評価しなければならない17,21,22。

Protocol

プロトコルの図については、 図 1 を参照してください。倫理的クリアランスは、人間の血液の回収と使用について、プレトリア大学健康科学倫理委員会(506/2018)から取得されました。 1. 配偶子細胞培養 注:SMFAを設立する前に、プレトリア大学で配偶子細胞培養が準備されました(完全なプロトコルについては、Readerら<…

Representative Results

解剖された対照標本の総数は47であり、平均89%の有病率と中腸あたり9.5のオーシストの強度でした(表1、以前に発表された22)。化合物MMV1581558の場合、サンプルサイズは合計42検体に達し、オーシスト有病率は36%、平均強度は1.5オーシストでした。これは、3つの生物学的複製すべてにわたってオーシスト有病率が58%、TRAが82%減少したことを示しています(表1</…

Discussion

このプロトコルを正常に実行するには、面倒で面倒なプロセスであっても、各ステップに注意を払う必要があります。最も重要なステップの1つは、SMFA23,24を開始する前に、配偶子細胞培養が良質であり、正しい雄:雌比の成熟配偶細胞で構成されていることを確認することです。SMFAの間、配偶子細胞培養を正しい温度に維持して、雄の配偶子が蚊?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は教授に感謝したいと思います。プレトリア大学の持続可能なマラリア対策研究所生化学、遺伝学、微生物学部のリン・マリ・バークホルツとジャネット・リーダー博士が配偶子細胞培養の培養と供給を担当しました。寄生虫株は後者の部門から入手した(この出版物の一部ではない)。科学イノベーション省(DSI)および国立研究財団(NRF)。南アフリカ研究議長イニシアチブ(UID 64763からLKおよびUID 84627からLMB);NRF実践コミュニティ(UID 110666 LMBおよびLK);南アフリカ医学研究評議会の戦略的ヘルスイノベーションパートナーシップ(SHIP)も、DSIからの資金提供で認められています。

Materials

Bovine intestine/ Butchery
Compound MMV1581558 MMV Pandemic response box
Dissecting needles WRIM Custom made
falcon tube Lasec
Glass feeders Glastechniek Peter Coelen B.V.
Graphpad Prism (8.3.0) Graphpad
Mercurochrome Merck (Sigma-Aldrich) 129-16-8
Microscope slides Merch (Sigma-Aldrich) S8902
Parafilm Cleansafe
PBS tablets ThermoFisher Scientific BP2944
Perspex biosafety cabinet Wits University Made by the contractors at Wits
Plastic cups (350 mL) Plastic Land

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Cite This Article
Erlank, E., Venter, N., Koekemoer, L. L. Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors. J. Vis. Exp. (183), e63546, doi:10.3791/63546 (2022).

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