Ensayo estándar de alimentación por membrana para la detección de la infección por Plasmodium falciparum en mosquitos vectores Anopheles
Summary
El ensayo estándar de alimentación por membrana (SMFA) se considera el estándar de oro para la evaluación e identificación de posibles compuestos antipalúdicos. Este sistema de alimentación artificial se utiliza para infectar mosquitos para evaluar más a fondo los efectos de tales compuestos sobre la intensidad y prevalencia del parásito Plasmodium falciparum .
Abstract
La malaria sigue siendo una de las enfermedades más devastadoras en todo el mundo y, hasta la fecha, la región africana sigue siendo responsable del 94% de todos los casos en todo el mundo. Esta enfermedad parasitaria requiere un parásito protozoario, un mosquito vector Anopheles y un huésped vertebrado. El género Anopheles comprende más de 500 especies, de las cuales 60 son conocidas como vectores del parásito. El género del parásito Plasmodium consta de 250 especies, y 48 de ellas están involucradas en la transmisión de enfermedades. Además, el parásito Plasmodium falciparum ha contribuido a un estimado del 99,7% de los casos de malaria en el África subsahariana en los últimos años.
Los gametocitos forman parte de la etapa sexual del parásito y son ingeridos por el mosquito hembra al alimentarse de un huésped humano infectado. El desarrollo adicional del parásito dentro del mosquito se ve reforzado por las condiciones ambientales favorables en el intestino medio del mosquito. Aquí, tiene lugar la fusión de los gametos femeninos y masculinos, y se originan los ookinetes móviles. Los ookinetes entran en el epitelio del intestino medio del mosquito, y los ookinetes maduros forman ooquistes, que, a su vez, producen esporozoítos móviles. Estos esporozoítos migran a las glándulas salivales del mosquito y se inyectan cuando un mosquito toma una comida de sangre.
Para fines de descubrimiento de fármacos, los mosquitos se infectaron artificialmente con sangre infectada con gametocitos en el ensayo estándar de alimentación por membrana (SMFA). Para detectar la infección dentro del mosquito y/o para evaluar la eficacia de los compuestos antipalúdicos, los intestinos medios de los mosquitos hembra se eliminaron después de la infección y se tiñeron con mercurocromo. Este método se utilizó para mejorar la detección visual de ooquistes bajo el microscopio para la determinación precisa de la prevalencia e intensidad del ooquiste.
Introduction
La malaria, conocida como una de las enfermedades más destructivas del mundo, todavía representa una gran amenaza para varios países, especialmente aquellos dentro de la región africana, y contribuye a aproximadamente el 95% de los casos en todo el mundo1. Esta enfermedad es causada por un parásito protozoario y, junto con su mosquito vector Anopheles, estos culpables pueden causar un gran daño al huésped humano2. Más específicamente, la especie falciparum del género parásito Plasmodium es responsable de aproximadamente el 99% de los casos de malaria en el África subsahariana1. Además de esto, varios vectores principales del mosquito Anopheles (incluidos An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n. y An. funestus Giles) podrían ser culpados por más del 95% de la transmisión de parásitos a nivel mundial 3,4,5,6,7,8 . Para que se establezca la compañía ideal parásito-vector, el mosquito vector debe ser susceptible al parásito y ser capaz de transmitirlo9. Además, tanto el vector como el parásito deben superar las barreras físicas para formar la combinación infectiva perfecta: el mosquito vector debe ser capaz de mantener el desarrollo del parásito y el parásito debe tener la capacidad de superar los mecanismos de defensa del huésped10,11.
Los gametocitos, la etapa sexual del parásito P. falciparum, juegan un papel crucial en la conexión del vector y los socios parásitos12. El desarrollo sexual tiene lugar in vivo, y la gametocitogénesis describe el proceso de diferenciación de gametocitos maduros en microgametos masculinos móviles y macrogametos femeninos13. Otro proceso que tiene lugar dentro del mosquito es la exflagelación, el proceso durante el cual el gametocito masculino se transforma en gametos y emerge de los glóbulos rojos absorbidos durante una comida de sangre11. Se sugiere además que el proceso de exflagelación se vea reforzado por un cambio favorable en el entorno del intestino medio del mosquito14. Después de la exflagelación, un cigoto se forma por la fusión de los gametos masculino y femenino13. Del cigoto, surge un ookinete móvil que se mueve de la harina de sangre al epitelio del intestino medio del mosquito13. Aquí, el ookinete madura y se forma un ooquiste, que, a su vez, produce esporozoítos móviles13,15. Los esporozoítos luego migran a las glándulas salivales del mosquito y, a medida que el mosquito toma una comida de sangre de su huésped, estos esporozoítos se inyectan en el torrente sanguíneo del huésped15.
Las intervenciones de control de la malaria, que combinan estrategias de control de vectores y el uso de medicamentos antipalúdicos eficaces, se han vuelto cruciales para combatir esta enfermedad15. Con un aumento de la resistencia a los parásitos y mosquitos, la urgencia de la identificación de nuevos compuestos antipalúdicos está aumentando16. Por lo tanto, la evaluación in vivo de los compuestos bloqueadores de la transmisiónes importante 16. Después del desarrollo de tales fármacos eficaces bloqueadores de la transmisión, el SMFA se ha utilizado para evaluar si estos compuestos inhiben el desarrollo sexual de P. falciparum en el mosquito Anopheles 17,18,19. Este ensayo ha ganado reconocimiento desde los años 1970-1980 como el estándar de oro para evaluar el bloqueo de la transmisión20,21. Este ensayo proporciona una alternativa más barata que otros ensayos como RT-qPCR, que requiere equipo especializado. Además, no se necesitan pacientes para ejecutar los experimentos. Este ensayo también implica la provisión de sangre inducida por gametocitos a mosquitos hembra, que luego se diseccionan para evaluar si el desarrollo de ooquistes está presente21. Esto permite la cuantificación de gametocitos y la detección de ooquistes deformados debido a los compuestos22. Para que un compuesto sea clasificado como efectivo, la prevalencia (la proporción de mosquitos que albergan al menos un ooquiste en el intestino medio) y el número de ooquistes (intensidad) en el intestino medio del mosquito deben ser evaluados para evaluar la inhibición de la infección 17,21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para que este protocolo se ejecute con éxito, se debe prestar atención a cada paso, aunque pueda ser un proceso tedioso y laborioso. Uno de los pasos más importantes es asegurar que el cultivo de gametocitos sea de buena calidad y que esté formado por gametocitos maduros, con la proporción correcta macho:hembra, antes de iniciar el SMFA23,24. Durante el SMFA, también es crucial mantener el cultivo de gametocitos a la temperatura correcta para evitar que los…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Prof. Lyn-Mari Birkholtz y la Dra. Janette Reader del Departamento de Bioquímica, Genética y Microbiología, Instituto para el Control Sostenible de la Malaria, en la Universidad de Pretoria, por cultivar y suministrar el cultivo de gametocitos. La cepa del parásito se obtuvo de este último departamento (no forma parte de esta publicación). El Departamento de Ciencia e Innovación (DSI) y la Fundación Nacional de Investigación (NRF); Iniciativa de Cátedras de Investigación de Sudáfrica (UID 64763 a LK y UID 84627 a LMB); las Comunidades de Práctica de la NRF (UID 110666 a LMB y LK); y las Asociaciones de Innovación Estratégica en Salud (SHIP) del Consejo de Investigación Médica de Sudáfrica también son reconocidas por los fondos del DSI.
Materials
| Bovine intestine/ | Butchery | ||
| Compound MMV1581558 | MMV | Pandemic response box | |
| Dissecting needles | WRIM | Custom made | |
| falcon tube | Lasec | ||
| Glass feeders | Glastechniek Peter Coelen B.V. | ||
| Graphpad Prism (8.3.0) | Graphpad | ||
| Mercurochrome | Merck (Sigma-Aldrich) | 129-16-8 | |
| Microscope slides | Merch (Sigma-Aldrich) | S8902 | |
| Parafilm | Cleansafe | ||
| PBS tablets | ThermoFisher Scientific | BP2944 | |
| Perspex biosafety cabinet | Wits University | Made by the contractors at Wits | |
| Plastic cups (350 mL) | Plastic Land |
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