Une procédure de post-fixation modifiée augmente le contraste des particules de glycogène dans les tissus. Cet article fournit un protocole étape par étape décrivant comment manipuler le tissu, effectuer l’imagerie et utiliser des méthodes stéréologiques pour obtenir des données impartiales et quantitatives sur la distribution du glycogène subcellulaire spécifique au type de fibre dans le muscle squelettique.
Avec l’utilisation de la microscopie électronique à transmission, des images à haute résolution d’échantillons fixes contenant des fibres musculaires individuelles peuvent être obtenues. Cela permet de quantifier les aspects ultrastructuraux tels que les fractions volumiques, les rapports surface/volume, la morphométrie et les sites de contact physique de différentes structures subcellulaires. Dans les années 1970, un protocole pour améliorer la coloration du glycogène dans les cellules a été développé et a ouvert la voie à une série d’études sur la localisation subcellulaire du glycogène et la taille des particules de glycogène à l’aide de la microscopie électronique à transmission. Alors que la plupart des analyses interprètent le glycogène comme s’il était réparti de manière homogène dans les fibres musculaires, ne fournissant qu’une seule valeur (par exemple, une concentration moyenne), la microscopie électronique à transmission a révélé que le glycogène est stocké sous forme de particules de glycogène discrètes situées dans des compartiments subcellulaires distincts. Ici, le protocole étape par étape de la collecte de tissus à la détermination quantitative de la fraction volumique et du diamètre des particules de glycogène dans les compartiments subcellulaires distincts des fibres musculaires squelettiques individuelles est décrit. Considérations sur la façon de 1) prélever et colorer des échantillons de tissus, 2) effectuer des analyses d’images et le traitement des données, 3) évaluer la précision des estimations, 4) discriminer entre les types de fibres musculaires, et 5) les pièges méthodologiques et les limites sont inclus.
Les particules de glycogène sont composées de polymères ramifiés de glucose et de diverses protéines associées1 et constituent un carburant important lors de demandes métaboliques élevées2. Bien qu’elles ne soient pas largement reconnues, les particules de glycogène constituent également un carburant local, où certains processus subcellulaires utilisent préférentiellement le glycogène malgré la disponibilité d’autres carburants plus durables comme le glucose plasmatique et les acides gras3,4.
L’importance du stockage du glycogène en tant que combustible localisé spécifique subcellulaire a été discutée dans plusieurs revues5,6 principalement basées sur certaines des premières documentations sur la distribution subcellulaire du glycogène par microscopie électronique à transmission (TEM)7,8. Les premières études ont utilisé différents protocoles pour augmenter le contraste du glycogène des techniques de coloration histochimique aux colorations négatives et positives9,10. Un développement méthodologique important a été le protocole de post-fixation raffiné avec l’osmium réduit en ferrocyanure de potassium11,12,13,14, qui a considérablement amélioré le contraste des particules de glycogène. Ce protocole affiné n’a pas été utilisé dans certains des travaux pionniers sur l’épuisement du glycogène induit par l’exercice15, mais a été réintroduit par Graham et ses collègues16,17.
Sur la base des images en 2 dimensions, la distribution subcellulaire du glycogène est le plus souvent décrite comme des particules de glycogène situées dans trois pools: subsarcolemmal (juste sous la membrane de surface), intermyofibrillaire (entre les myofibrillaires) ou intramyofibrillaire (dans les myofibrillaires). Cependant, les particules de glycogène pourraient également être décrites comme associées, par exemple, au réticulum sarcoplasmique7 ou aux noyaux18. En plus de la distribution subcellulaire, l’avantage de la teneur en glycogène estimée par TEM est également que la quantification peut être effectuée au niveau de la fibre unique. Cela permet d’étudier la variabilité fibre à fibre et d’effectuer des analyses corrélatives avec les types de fibres et les composants cellulaires tels que les mitochondries et les gouttelettes lipidiques.
Ici, le protocole pour le contenu volumétrique spécifique au type de fibre TEM estimé des trois pools subcellulaires communs de glycogène (sous-sarmateux, intermyofibrillaire et intramyofibrillaire) dans les fibres musculaires squelettiques est décrit. La méthode a été appliquée aux muscles squelettiques des humains19, des rats20 et des souris21; ainsi que les oiseaux et les poissons22; et les cardiomyocytes de rats23.
L’étape critique de la méthode est l’utilisation d’osmium réduit par le ferrocyanure de potassium pendant la post-fixation. La sélectivité de ce fixateur modifié pour la détection du glycogène ne peut pas être entièrement expliquée par la chimie, mais comprend également des résultats expérimentaux démontrant qu’aucune détection de telles particules dans des tissus connus pour être exempts de glycogène ou dans l’espace extracellulaire11.
Les p…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le Comité olympique suédois.
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Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
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