Quantification de la distribution subcellulaire du glycogène dans les fibres musculaires squelettiques à l’aide de la microscopie électronique à transmission
Summary
Une procédure de post-fixation modifiée augmente le contraste des particules de glycogène dans les tissus. Cet article fournit un protocole étape par étape décrivant comment manipuler le tissu, effectuer l’imagerie et utiliser des méthodes stéréologiques pour obtenir des données impartiales et quantitatives sur la distribution du glycogène subcellulaire spécifique au type de fibre dans le muscle squelettique.
Abstract
Avec l’utilisation de la microscopie électronique à transmission, des images à haute résolution d’échantillons fixes contenant des fibres musculaires individuelles peuvent être obtenues. Cela permet de quantifier les aspects ultrastructuraux tels que les fractions volumiques, les rapports surface/volume, la morphométrie et les sites de contact physique de différentes structures subcellulaires. Dans les années 1970, un protocole pour améliorer la coloration du glycogène dans les cellules a été développé et a ouvert la voie à une série d’études sur la localisation subcellulaire du glycogène et la taille des particules de glycogène à l’aide de la microscopie électronique à transmission. Alors que la plupart des analyses interprètent le glycogène comme s’il était réparti de manière homogène dans les fibres musculaires, ne fournissant qu’une seule valeur (par exemple, une concentration moyenne), la microscopie électronique à transmission a révélé que le glycogène est stocké sous forme de particules de glycogène discrètes situées dans des compartiments subcellulaires distincts. Ici, le protocole étape par étape de la collecte de tissus à la détermination quantitative de la fraction volumique et du diamètre des particules de glycogène dans les compartiments subcellulaires distincts des fibres musculaires squelettiques individuelles est décrit. Considérations sur la façon de 1) prélever et colorer des échantillons de tissus, 2) effectuer des analyses d’images et le traitement des données, 3) évaluer la précision des estimations, 4) discriminer entre les types de fibres musculaires, et 5) les pièges méthodologiques et les limites sont inclus.
Introduction
Les particules de glycogène sont composées de polymères ramifiés de glucose et de diverses protéines associées1 et constituent un carburant important lors de demandes métaboliques élevées2. Bien qu’elles ne soient pas largement reconnues, les particules de glycogène constituent également un carburant local, où certains processus subcellulaires utilisent préférentiellement le glycogène malgré la disponibilité d’autres carburants plus durables comme le glucose plasmatique et les acides gras3,4.
L’importance du stockage du glycogène en tant que combustible localisé spécifique subcellulaire a été discutée dans plusieurs revues5,6 principalement basées sur certaines des premières documentations sur la distribution subcellulaire du glycogène par microscopie électronique à transmission (TEM)7,8. Les premières études ont utilisé différents protocoles pour augmenter le contraste du glycogène des techniques de coloration histochimique aux colorations négatives et positives9,10. Un développement méthodologique important a été le protocole de post-fixation raffiné avec l’osmium réduit en ferrocyanure de potassium11,12,13,14, qui a considérablement amélioré le contraste des particules de glycogène. Ce protocole affiné n’a pas été utilisé dans certains des travaux pionniers sur l’épuisement du glycogène induit par l’exercice15, mais a été réintroduit par Graham et ses collègues16,17.
Sur la base des images en 2 dimensions, la distribution subcellulaire du glycogène est le plus souvent décrite comme des particules de glycogène situées dans trois pools: subsarcolemmal (juste sous la membrane de surface), intermyofibrillaire (entre les myofibrillaires) ou intramyofibrillaire (dans les myofibrillaires). Cependant, les particules de glycogène pourraient également être décrites comme associées, par exemple, au réticulum sarcoplasmique7 ou aux noyaux18. En plus de la distribution subcellulaire, l’avantage de la teneur en glycogène estimée par TEM est également que la quantification peut être effectuée au niveau de la fibre unique. Cela permet d’étudier la variabilité fibre à fibre et d’effectuer des analyses corrélatives avec les types de fibres et les composants cellulaires tels que les mitochondries et les gouttelettes lipidiques.
Ici, le protocole pour le contenu volumétrique spécifique au type de fibre TEM estimé des trois pools subcellulaires communs de glycogène (sous-sarmateux, intermyofibrillaire et intramyofibrillaire) dans les fibres musculaires squelettiques est décrit. La méthode a été appliquée aux muscles squelettiques des humains19, des rats20 et des souris21; ainsi que les oiseaux et les poissons22; et les cardiomyocytes de rats23.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’étape critique de la méthode est l’utilisation d’osmium réduit par le ferrocyanure de potassium pendant la post-fixation. La sélectivité de ce fixateur modifié pour la détection du glycogène ne peut pas être entièrement expliquée par la chimie, mais comprend également des résultats expérimentaux démontrant qu’aucune détection de telles particules dans des tissus connus pour être exempts de glycogène ou dans l’espace extracellulaire11.
Les p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Comité olympique suédois.
Materials
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
References
- Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. The dynamic life of the glycogen granule. Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).
- Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates. Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).
- James, J. H., et al. Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).
- Jensen, R., Nielsen, J., Ørtenblad, N. Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).
- Green, H. J. How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).
- Fitts, R. H. Cellular mechanisms of muscle fatigue. Physiological Reviews. 74 (1), 49-94 (1994).
- Wanson, J. C., Drochmans, P. Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism. Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).
- Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. Fiber types in the human brachial biceps muscle. Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).
- Drochmans, P. Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Thiery, J. -. P. Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy. Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).
- De Bruijn, W. C. Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen. Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).
- Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation. The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).
- Rybicka, K. K. Glycosomes – the organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Gadisseux, J. F., Evrard, P. Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus. Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).
- Fridén, J., Seger, J., Ekblom, B. Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise. Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).
- Marchand, I., et al. Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location. Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).
- Marchand, I., et al. Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise. Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).
- Sun, R. C., et al. Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers. Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).
- Jensen, R., et al. Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men. Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).
- Nielsen, J., Schrøder, H. D., Rix, C. G., Ørtenblad, N. Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).
- Nielsen, J., Cheng, A. J., Ørtenblad, N., Westerblad, H. Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres. Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).
- Mead, A. F., et al. Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates. eLife. 6, 29425 (2017).
- Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., Ørtenblad, N., Bøtker, H. E. Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning. Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).
- Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schrøder, H. D., Saltin, B., Ørtenblad, N. Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type. Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).
- Weibel, E. R. . Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , (1980).
- Gundersen, H. J., et al. Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).
- Saltin, B., Gollnick, P. D. Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance. Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, 555-632 (1983).
- Howard, C. V., Reed, M. G. . Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , (2005).
- Nielsen, J., et al. Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).
- Hokken, R., et al. Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters. Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).
- Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions. PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).
- Sjöström, M., et al. Morphometric analyses of human muscle fiber types. Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).
- Gejl, K. D., et al. Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
