Количественная оценка распределения субклеточного гликогена в волокнах скелетных мышц с помощью просвечивающей электронной микроскопии
Summary
Модифицированная процедура постфиксации увеличивает контраст частиц гликогена в ткани. В этой статье представлен пошаговый протокол, описывающий, как обращаться с тканью, проводить визуализацию и использовать стереологические методы для получения объективных и количественных данных о распределении субклеточного гликогена в скелетных мышцах.
Abstract
С помощью просвечивающей электронной микроскопии можно получить изображения с высоким разрешением неподвижных образцов, содержащих отдельные мышечные волокна. Это позволяет количественно оценивать ультраструктурные аспекты, такие как объемные фракции, отношение площади поверхности к объему, морфометрия и физические контакты различных субклеточных структур. В 1970-х годах был разработан протокол усиленного окрашивания гликогена в клетках, который проложил путь для серии исследований субклеточной локализации гликогена и размера частиц гликогена с использованием просвечивающей электронной микроскопии. В то время как большинство анализов интерпретируют гликоген так, как если бы он равномерно распределялся внутри мышечных волокон, обеспечивая только одно значение (например, среднюю концентрацию), просвечивающая электронная микроскопия показала, что гликоген хранится в виде дискретных частиц гликогена, расположенных в отдельных субклеточных компартментах. Здесь описан пошаговый протокол от сбора тканей до количественного определения объемной фракции и диаметра частиц гликогена в отдельных субклеточных компартментах отдельных волокон скелетных мышц. Включены соображения о том, как 1) собирать и окрашивать образцы тканей, 2) выполнять анализ изображений и обработку данных, 3) оценивать точность оценок, 4) различать типы мышечных волокон и 5) методологические подводные камни и ограничения.
Introduction
Частицы гликогена состоят из разветвленных полимеров глюкозы и различных связанных с ней белков1 и являются важным топливом во время высоких метаболических потребностей2. Хотя частицы гликогена не получили широкого признания, они также представляют собой местное топливо, где некоторые субклеточные процессы преимущественно используют гликоген, несмотря на наличие других и более долговечных видов топлива, таких как глюкоза плазмы и жирные кислоты3,4.
Важность хранения гликогена в качестве субклеточного специфического локализованного топлива обсуждалась в нескольких обзорах5,6, в основном на основе некоторых из самых ранних документов о субклеточном распределении гликогена с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ)7,8. В первых исследованиях использовались различные протоколы для увеличения контраста гликогена от методов гистохимического окрашивания к отрицательным и положительным окрашиваниям9,10. Важной методологической разработкой стал уточненный протокол постфиксации с ферроцианидом калия-восстановленным осмием11,12,13,14, что значительно улучшило контраст частиц гликогена. Этот усовершенствованный протокол не использовался в некоторых новаторских работах по истощению гликогена, вызванному физическими упражнениями15, но был вновь введен Грэмом и его коллегами16,17.
Основываясь на 2-мерных изображениях, субклеточное распределение гликогена чаще всего описывается как частицы гликогена, расположенные в трех бассейнах: субсарколеммальном (прямо под поверхностной мембраной), интермиофибриллярном (между миофибриллами) или интрамиофибриллярном (в пределах миофибрилл). Однако частицы гликогена также могут быть описаны как связанные, например, с саркоплазматическим ретикулумом7 или ядрами18. В дополнение к субклеточному распределению, преимущество предполагаемого содержания гликогена, оцениваемого ТЕА, также заключается в том, что количественная оценка может проводиться на уровне одного волокна. Это позволяет исследовать изменчивость волокна к волокну и коррелятивный анализ с типами волокон и клеточными компонентами, такими как митохондрии и капли липидов.
Здесь описан протокол оценки ТЭМ типоспецифического объемного содержания трех общих субклеточных пулов гликогена (субсарколеммального, интермиофибриллярного и интрамиофибриллярного) в скелетных мышечных волокнах. Метод был применен к скелетным мышцам человека19, крыс20 и мышей21; а также птицы и рыбы22; и кардиомиоциты крыс23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критическим этапом метода является использование восстановленного осмия ферроцианидом калия во время постфиксации. Селективность этого модифицированного фиксатора для обнаружения гликогена не может быть полностью объяснена химией, но также включает экспериментальные результаты, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Шведским олимпийским комитетом.
Materials
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
References
- Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. The dynamic life of the glycogen granule. Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).
- Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates. Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).
- James, J. H., et al. Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).
- Jensen, R., Nielsen, J., Ørtenblad, N. Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).
- Green, H. J. How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).
- Fitts, R. H. Cellular mechanisms of muscle fatigue. Physiological Reviews. 74 (1), 49-94 (1994).
- Wanson, J. C., Drochmans, P. Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism. Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).
- Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. Fiber types in the human brachial biceps muscle. Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).
- Drochmans, P. Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Thiery, J. -. P. Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy. Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).
- De Bruijn, W. C. Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen. Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).
- Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation. The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).
- Rybicka, K. K. Glycosomes – the organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Gadisseux, J. F., Evrard, P. Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus. Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).
- Fridén, J., Seger, J., Ekblom, B. Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise. Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).
- Marchand, I., et al. Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location. Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).
- Marchand, I., et al. Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise. Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).
- Sun, R. C., et al. Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers. Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).
- Jensen, R., et al. Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men. Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).
- Nielsen, J., Schrøder, H. D., Rix, C. G., Ørtenblad, N. Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).
- Nielsen, J., Cheng, A. J., Ørtenblad, N., Westerblad, H. Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres. Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).
- Mead, A. F., et al. Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates. eLife. 6, 29425 (2017).
- Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., Ørtenblad, N., Bøtker, H. E. Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning. Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).
- Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schrøder, H. D., Saltin, B., Ørtenblad, N. Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type. Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).
- Weibel, E. R. . Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , (1980).
- Gundersen, H. J., et al. Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).
- Saltin, B., Gollnick, P. D. Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance. Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, 555-632 (1983).
- Howard, C. V., Reed, M. G. . Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , (2005).
- Nielsen, J., et al. Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).
- Hokken, R., et al. Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters. Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).
- Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions. PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).
- Sjöström, M., et al. Morphometric analyses of human muscle fiber types. Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).
- Gejl, K. D., et al. Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
