القياس الكمي لتوزيع الجليكوجين تحت الخلوي في ألياف العضلات الهيكلية باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل
Summary
يزيد إجراء ما بعد التثبيت المعدل من تباين جزيئات الجليكوجين في الأنسجة. توفر هذه الورقة بروتوكولا خطوة بخطوة يصف كيفية التعامل مع الأنسجة وإجراء التصوير واستخدام الأساليب المجسمة للحصول على بيانات كمية وغير متحيزة حول توزيع الجليكوجين تحت الخلوي الخاص بنوع الألياف في العضلات الهيكلية.
Abstract
باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل ، يمكن الحصول على صور عالية الدقة لعينات ثابتة تحتوي على ألياف عضلية فردية. وهذا يتيح تحديد كميات الجوانب فوق الهيكلية مثل كسور الحجم ، ونسب المساحة السطحية إلى الحجم ، و morphometry ، ومواقع الاتصال المادي للهياكل تحت الخلوية المختلفة. في 1970s ، تم تطوير بروتوكول لتعزيز تلطيخ الجليكوجين في الخلايا ومهد الطريق لسلسلة من الدراسات حول التوطين تحت الخلوي لحجم جسيمات الجليكوجين والجليكوجين باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل. في حين أن معظم التحليلات تفسر الجليكوجين كما لو كان موزعا بشكل متجانس داخل ألياف العضلات ، مما يوفر قيمة واحدة فقط (على سبيل المثال ، متوسط التركيز) ، فقد كشف المجهر الإلكتروني الناقل أن الجليكوجين يتم تخزينه كجزيئات جليكوجين منفصلة تقع في مقصورات دون خلوية متميزة. هنا ، يتم وصف البروتوكول خطوة بخطوة من جمع الأنسجة إلى التحديد الكمي للجزء الحجمي وقطر الجسيمات من الجليكوجين في المقصورات تحت الخلوية المميزة لألياف العضلات الهيكلية الفردية. اعتبارات حول كيفية 1) جمع عينات الأنسجة ووصمها ، 2) إجراء تحليلات الصور ومعالجة البيانات ، 3) تقييم دقة التقديرات ، 4) التمييز بين أنواع الألياف العضلية ، و 5) يتم تضمين المزالق والقيود المنهجية.
Introduction
تتكون جزيئات الجليكوجين من بوليمرات متفرعة من الجلوكوز ومختلف البروتينات المرتبطة بها1 وتشكل وقودا مهما خلال المتطلبات الأيضية العالية2. على الرغم من عدم الاعتراف بها على نطاق واسع، إلا أن جزيئات الجليكوجين تشكل أيضا وقودا محليا، حيث تستخدم بعض العمليات دون الخلوية الجليكوجين بشكل تفضيلي على الرغم من توافر أنواع وقود أخرى طويلة الأمد مثل جلوكوز البلازما والأحماض الدهنية3,4.
نوقشت أهمية تخزين الجليكوجين كوقود موضعي محدد تحت الخلية في العديد من المراجعات5,6 استنادا أساسا إلى بعض الوثائق المبكرة للتوزيع تحت الخلوي للجليكوجين عن طريق المجهر الإلكتروني الناقل (TEM)7,8. استخدمت الدراسات الأولى بروتوكولات مختلفة لزيادة تباين الجليكوجين من تقنيات التلطيخ الكيميائي النسيجي إلى البقع السلبية والإيجابية9,10. كان التطور المنهجي المهم هو بروتوكول ما بعد التثبيت المكرر مع الأوزميوم المخفض بفيروسيانيد البوتاسيوم 11،12،13،14 ، مما أدى إلى تحسين كبير في تباين جزيئات الجليكوجين. لم يستخدم هذا البروتوكول المكرر في بعض الأعمال الرائدة حول استنفاد الجليكوجين الناجم عن التمرين15 ولكن أعيد تقديمه من قبل غراهام وزملاؤه16،17.
استنادا إلى الصور ذات الأبعاد 2 ، غالبا ما يوصف التوزيع تحت الخلوي للجليكوجين بأنه جزيئات جليكوجين تقع في ثلاثة تجمعات: تحت القصبة (تحت الغشاء السطحي مباشرة) ، intermyofibrillar (بين myofibrils) ، أو intramyofibrillar (داخل myofibrils). ومع ذلك، يمكن أيضا وصف جزيئات الجليكوجين بأنها مرتبطة مثلا بالشبكة الساركوبلازمية7 أو النوى18. بالإضافة إلى التوزيع تحت الخلوي ، فإن ميزة محتوى الجليكوجين المقدر من TEM هي أيضا أنه يمكن إجراء القياس الكمي على مستوى الألياف المفردة. وهذا يسمح بالتحقيق في التباين من الألياف إلى الألياف والتحليلات المرتبطة بأنواع الألياف والمكونات الخلوية مثل الميتوكوندريا وقطرات الدهون.
هنا ، يتم وصف بروتوكول المحتوى الحجمي الخاص بنوع الألياف المقدر من TEM للمجمعات تحت الخلوية الثلاثة الشائعة من الجليكوجين (تحت الساركوليمال ، intermyofibrillar ، و intramyofibrillar) في ألياف العضلات الهيكلية. تم تطبيق هذه الطريقة على عضلات الهيكل العظمي من البشر19 والجرذان20 والفئران21. وكذلك الطيور والأسماك22 ؛ والخلايا العضلية القلبية من الفئران23.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوة الحاسمة لهذه الطريقة هي استخدام الأوزميوم المنخفض بواسطة فيروسيانيد البوتاسيوم أثناء التثبيت التالي. لا يمكن تفسير انتقائية هذا المثبت المعدل للكشف عن الجليكوجين بشكل كامل من خلال الكيمياء، ولكنه يشمل أيضا النتائج التجريبية التي تظهر عدم اكتشاف مثل هذه الجسيمات في الأنسجة المعر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت اللجنة الأولمبية السويدية هذا العمل.
Materials
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
References
- Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. The dynamic life of the glycogen granule. Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).
- Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates. Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).
- James, J. H., et al. Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).
- Jensen, R., Nielsen, J., Ørtenblad, N. Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).
- Green, H. J. How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).
- Fitts, R. H. Cellular mechanisms of muscle fatigue. Physiological Reviews. 74 (1), 49-94 (1994).
- Wanson, J. C., Drochmans, P. Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism. Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).
- Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. Fiber types in the human brachial biceps muscle. Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).
- Drochmans, P. Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Thiery, J. -. P. Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy. Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).
- De Bruijn, W. C. Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen. Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).
- Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation. The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).
- Rybicka, K. K. Glycosomes – the organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Gadisseux, J. F., Evrard, P. Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus. Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).
- Fridén, J., Seger, J., Ekblom, B. Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise. Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).
- Marchand, I., et al. Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location. Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).
- Marchand, I., et al. Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise. Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).
- Sun, R. C., et al. Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers. Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).
- Jensen, R., et al. Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men. Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).
- Nielsen, J., Schrøder, H. D., Rix, C. G., Ørtenblad, N. Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).
- Nielsen, J., Cheng, A. J., Ørtenblad, N., Westerblad, H. Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres. Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).
- Mead, A. F., et al. Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates. eLife. 6, 29425 (2017).
- Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., Ørtenblad, N., Bøtker, H. E. Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning. Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).
- Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schrøder, H. D., Saltin, B., Ørtenblad, N. Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type. Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).
- Weibel, E. R. . Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , (1980).
- Gundersen, H. J., et al. Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).
- Saltin, B., Gollnick, P. D. Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance. Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, 555-632 (1983).
- Howard, C. V., Reed, M. G. . Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , (2005).
- Nielsen, J., et al. Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).
- Hokken, R., et al. Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters. Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).
- Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions. PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).
- Sjöström, M., et al. Morphometric analyses of human muscle fiber types. Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).
- Gejl, K. D., et al. Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
