투과 전자 현미경을 이용한 골격근섬유의 세포하 글리코겐 분포의 정량화
Summary
수정 된 고정 후 절차는 조직에서 글리코겐 입자의 대비를 증가시킵니다. 이 논문은 조직을 처리하고, 이미징을 수행하고, 입체 학적 방법을 사용하여 골격근에서 섬유 유형 별 세포 내 글리코겐 분포에 대한 편향되지 않은 정량적 데이터를 얻는 방법을 설명하는 단계별 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
투과 전자 현미경을 사용하면 개별 근육 섬유를 포함하는 고정 샘플의 고해상도 이미지를 얻을 수 있습니다. 이것은 부피 분율, 표면적 대 부피비, 형태학 및 상이한 아세포 구조의 물리적 접촉 부위와 같은 초구조적 측면의 정량화를 가능하게 한다. 1970년대에는 세포에서 글리코겐의 강화된 염색을 위한 프로토콜이 개발되었고, 투과 전자 현미경을 이용한 글리코겐 및 글리코겐 입자 크기의 세포내 국소화에 관한 일련의 연구를 위한 길을 열었다. 대부분의 분석은 글리코겐이 근육 섬유 내에 균질하게 분포되어 있는 것처럼 해석하고 단 하나의 값(예를 들어, 평균 농도)만을 제공하는 반면, 투과 전자 현미경 검사는 글리코겐이 별개의 세포 하부 구획에 위치한 분리된 글리코겐 입자로서 저장된다는 것을 밝혀냈다. 여기서, 조직 수집으로부터 개별 골격근 섬유의 별개의 세포내 구획에서 글리코겐의 부피 분획 및 입자 직경의 정량적 결정을 위한 단계별 프로토콜이 기재되어 있다. 1) 조직 표본 수집 및 얼룩 방법, 2) 이미지 분석 및 데이터 처리 수행, 3) 추정치의 정밀도 평가, 4) 근섬유 유형 차별, 5) 방법론적 함정 및 한계에 대한 고려 사항이 포함됩니다.
Introduction
글리코겐 입자는 포도당과 다양한 관련 단백질1의 분지형 중합체로 구성되며 높은 대사 요구시 중요한 연료를 구성합니다2. 널리 인식되지는 않지만, 글리코겐 입자는 또한 국소 연료를 구성하며, 일부 세포 하부 공정은 혈장 글루코스 및 지방산과 같은 다른 더 오래 지속되는 연료의 가용성에도 불구하고 글리코겐을 우선적으로 이용한다3,4.
글리코겐을 세포내 특이적 국부적 연료로서 저장하는 것의 중요성은 여러 리뷰5,6에서 논의되었으며, 주로 투과 전자 현미경(TEM)7,8에 의한 글리코겐의 세포하 분포에 대한 초기 문서 중 일부에 기초한다. 첫 번째 연구는 조직 화학 염색 기술에서 음성 및 양성 염색에 이르기까지 글리코겐의 대비를 높이기 위해 다른 프로토콜을 사용했습니다.9,10. 중요한 방법론 적 개발은 칼륨 페로시아나이드 환원 osmium11,12,13,14를 사용한 정제 된 사후 고정 프로토콜이었으며, 이는 글리코겐 입자의 대비를 크게 향상 시켰습니다. 이 세련된 프로토콜은 운동으로 인한 글리코겐 고갈에 대한 선구적인 연구15에는 사용되지 않았지만 그레이엄과 동료들에 의해 다시 도입되었습니다16,17.
2차원 이미지에 기초하여, 글리코겐의 세포하 분포는 가장 흔히 세 개의 풀에 위치한 글리코겐 입자로서 기술된다: 아사르콜렘말(표면막 바로 아래), 인터미오피브릴라(myofibrils 사이), 또는 근오피브릴라(myofibrils 내). 그러나, 글리코겐 입자는 또한 예를 들어, 사르코플라스마 망상7 또는 nuclei18과 관련된 것으로 기술될 수 있다. 세포내 분포에 더하여, TEM-추정된 글리코겐 함량의 이점은 또한 단일 섬유 수준에서 정량화가 수행될 수 있다는 것이다. 이를 통해 섬유 대 섬유 변동성을 조사하고 미토콘드리아와 지질 방울과 같은 섬유 유형 및 세포 구성 요소와의 상관 관계 분석을 수행 할 수 있습니다.
여기에서, 골격근 섬유에서 TEM-추정된 섬유 유형-특이적 용적 함량에 대한 프로토콜은 골격근 섬유에서 글리코겐의 세 가지 공통 서브 세포 풀(subsarcolemmal, intermyofibrillar, and intramyofibrillar)에 대해 기술된다. 상기 방법은 인간19, rats20, 및 mice21로부터의 골격근에 적용되었다; 새와 물고기뿐만 아니라22; 및 래트로부터의 심근세포23.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법의 중요한 단계는 고정 후 동안 칼륨 페로시아나이드에 의해 환원 된 오스뮴을 사용하는 것입니다. 글리코겐 검출을 위한 이 변형된 고정제의 선택성은 화학에 의해 완전히 설명될 수 없지만, 글리코겐이 없는 것으로 알려진 조직 또는 세포외 공간에서11에서 그러한 입자의 검출이 없음을 입증하는 실험 발견도 포함한다.
중요한 파라미터는 추정치의…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 스웨덴 올림픽 위원회의 지원을 받았다.
Materials
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
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