Summary

Preparazione di griglie di campionamento ad alta temperatura per crio-EM

Published: July 26, 2021
doi:

Summary

Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione di griglie di campioni a temperature fino a 70 °C, prima del congelamento a immersione per esperimenti crio-EM.

Abstract

Le griglie di campioni per esperimenti di crio-microscopia elettronica (crio-EM) sono solitamente preparate ad una temperatura ottimale per la conservazione di campioni biologici, per lo più a 4 °C e occasionalmente a temperatura ambiente. Recentemente, abbiamo scoperto che la struttura proteica risolta a bassa temperatura potrebbe non essere funzionalmente rilevante, in particolare per le proteine degli archei termofili. È stata sviluppata una procedura per preparare campioni proteici a temperature più elevate (fino a 70 °C) per l’analisi crio-EM. Abbiamo dimostrato che le strutture provenienti da campioni preparati a temperature più elevate sono funzionalmente rilevanti e dipendenti dalla temperatura. Qui descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di griglie di campioni ad alta temperatura, usando 55 °C come esempio. L’esperimento si è avvalso di un apparecchio di vetrificazione modificato mediante una provetta da centrifuga supplementare e i campioni sono stati incubati a 55 °C. Le procedure dettagliate sono state messe a punto per ridurre al minimo la condensa del vapore e ottenere un sottile strato di ghiaccio sulla griglia. Vengono forniti esempi di esperimenti riusciti e falliti.

Introduction

La tecnologia crio-EM per risolvere le strutture dei complessi proteici ha continuato a migliorare, in particolare nella direzione di ottenere strutture ad alta risoluzione 1,2. Nel frattempo, anche il panorama della sua applicazione è stato ampliato variando le condizioni del campione come pH o leganti prima del processo di vetrificazione3, che prevede la preparazione di griglie di campionamento seguite dal congelamento a tuffo 4,5. Un’altra condizione importante è la temperatura. Sebbene gli esperimenti crio-EM, come la cristallografia a raggi X, vengano eseguiti a basse temperature, la struttura risolta dalla crio-EM riflette la struttura allo stato di soluzione prima della vetrificazione. Fino a poco tempo fa, la maggior parte degli studi crio-EM di analisi di singole particelle (SPA) utilizza campioni che vengono conservati sul ghiaccio (cioè a 4 °C) prima della vetrificazione6, sebbene un certo numero di studi utilizzi campioni a temperatura ambiente di circa 7,8,9,10 o fino a 42 °C 11. In un recente rapporto, abbiamo eseguito studi dipendenti dalla temperatura dell’enzima cheto-acido riduttoisomerasi (KARI) dall’archeone termofilo Sulfolobus solfataricus (Sso) a sei diverse temperature da 4 ° C a 70 ° C12. I nostri studi suggeriscono che è importante preparare griglie di campioni a temperature funzionalmente rilevanti e che la crio-EM è l’unico metodo strutturale praticamente fattibile per risolvere la struttura dello stesso complesso proteico a più temperature.

La principale difficoltà per la vetrificazione ad alte temperature è ridurre al minimo la condensa del vapore e ottenere ghiaccio sottile. Qui riportiamo il protocollo dettagliato utilizzato per la preparazione di griglie campione ad alte temperature nel nostro precedente studio di Sso-KARI 12. Partiamo dal presupposto che i lettori o gli spettatori abbiano già esperienza nella preparazione complessiva del campione e nelle procedure di elaborazione dei dati per gli esperimenti crio-EM e sottolineiamo gli aspetti rilevanti per l’alta temperatura.

Protocol

NOTA: Questo protocollo mira ad utilizzare un apparato di vetrificazione commerciale modificato per preparare i campioni di microscopia crioelettronica (crio-EM) a temperature specifiche, in particolare superiori a 37 °C. La configurazione sperimentale complessiva è mostrata nella Figura 1. Il protocollo utilizza 55 °C come esempio. Per le condizioni specifiche ad altre temperature, fare riferimento alla tabella supplementare 2 nel riferimento12. <p class="jov…

Representative Results

La panoramica del basso ingrandimento è mostrata nella Figura 5A,B. Il pannello A è un esempio di griglia di successo. C’è un gradiente di ghiaccio dall’alto a sinistra (più spesso) al basso a destra (più sottile o vuoto). Tale griglia rende più facile trovare uno spessore appropriato dello strato di ghiaccio nell’area centrale adatto alla raccolta dei dati, come le caselle blu e verdi. La griglia B è troppo asciutta. I quadrati nella griglia hanno un contrasto lumino…

Discussion

Nella fase 1 del protocollo, assicurarsi che il tubo della centrifuga sia stato installato bene e non cada quando l’esperimento è in corso. A causa dell’accumulo di un gran numero di goccioline d’acqua nella camera, che potrebbero modificare la capacità di adsorbimento della carta da filtro, si raccomanda che il tempo complessivo dell’esperimento non superi i 30 minuti dopo che la camera dell’apparato di vetrificazione ha raggiunto la temperatura di equilibrio. Se il tempo di funzionamento supera i 30 minuti, l’operato…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano il Dr. Hervé Remigy di Thermo Fisher Scientific per gli utili consigli. Gli esperimenti crio-EM sono stati eseguiti presso l’Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM è sostenuto da Academia Sinica (Grant No. AS-CFII-108-110) e Taiwan Protein Project (sovvenzione n. AS-KPQ-109-TPP2). Gli autori ringraziano anche la signora Hui-Ju Huang per l’assistenza nella preparazione del campione.

Materials

Falcon tube Falcon 352070 size: 50 mL
Filter paper Ted Pella 47000-100 Ø55/20mm, Grade 595
HI1210 Leica water bath
K100X Electron Microscopy Sciences glow discharge
Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid Ted Pella 658-200-CU-100
Titan Krios G3 Thermo Fisher Scientific 1063996 low dose imaging
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific 1086439
Vitrobot Tweezer Ted Pella 47000-500

References

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Cite This Article
Chang, Y., Chen, C., Tsai, M. Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM. J. Vis. Exp. (173), e62772, doi:10.3791/62772 (2021).

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