Cryo-EM용 고온 시료 그리드 준비
Summary
이 백서는 Cryo-EM 실험을 위한 플런지 동결 전에 70°C의 높은 온도에서 샘플 그리드를 준비하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
초저온 전자 현미경(Cryo-EM) 실험을 위한 샘플 그리드는 일반적으로 생물학적 시료 보관에 최적의 온도(대부분 4°C, 때로는 실온)에서 준비됩니다. 최근에 우리는 저온에서 해결된 단백질 구조가 특히 고온성 고세균의 단백질에 대해 기능적으로 관련이 없을 수 있음을 발견했습니다. Cryo-EM 분석을 위해 더 높은 온도(최대 70°C)에서 단백질 샘플을 준비하는 절차가 개발되었습니다. 우리는 더 높은 온도에서 준비된 샘플의 구조가 기능적으로 관련이 있고 온도에 의존한다는 것을 보여주었습니다. 여기에서는 55°C를 예로 들어 고온에서 샘플 그리드를 준비하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 실험은 추가 원심분리 튜브를 사용하여 변형된 유리화 장치를 사용하여 샘플을 55°C에서 배양했습니다. 세부 절차는 증기 응축을 최소화하고 그리드에 얇은 얼음 층을 얻기 위해 미세 조정되었습니다. 성공한 실험과 실패한 실험의 예가 제공됩니다.
Introduction
단백질 복합체의 구조를 해결하기 위한 Cryo-EM 기술은 특히 고해상도 구조 1,2를 얻는 방향으로 지속적으로 개선되었습니다. 한편, 유리화 공정3 이전에 pH 또는 리간드와 같은 샘플 조건을 변경하여 적용 범위가 확장되었으며, 여기에는 샘플 그리드 준비 후 플런지 동결 4,5가 포함됩니다. 또 다른 중요한 조건은 온도입니다. X선 결정학과 같은 Cryo-EM 실험은 저온에서 수행되지만 Cryo-EM으로 해결된 구조는 유리화 전 용액 상태의 구조를 반영합니다. 최근까지 대부분의 단일 입자 분석(SPA) Cryo-EM 연구는유리화6 전에 얼음 위(즉, 4°C)에 보관된 샘플을 사용하지만 많은 연구에서 약실온 7,8,9,10 또는 최고 42°C에서 샘플을 사용합니다11. 최근 보고서에서 우리는 4 ° C에서 70 ° C까지의 6 가지 온도에서 고온 성 고세균 설포로부스 솔 파타 리쿠스 (Sso)의 효소 케톨산 환원 이소머 라제 (KARI)에 대한 온도 의존적 연구를 수행했습니다12. 당사의 연구에 따르면 기능적으로 관련된 온도에서 샘플 그리드를 준비하는 것이 중요하며 Cryo-EM은 여러 온도에서 동일한 단백질 복합체의 구조를 해석하는 데 실질적으로 실현 가능한 유일한 구조적 방법입니다.
고온에서 유리화의 주요 어려움은 증기 응축을 최소화하고 얇은 얼음을 얻는 것입니다. 여기에서는 Sso-KARI 12에 대한 이전 연구에서 고온에서 샘플 그리드를 준비하는 데 사용된 자세한 프로토콜을 보고합니다. 독자 또는 관찰자가 Cryo-EM 실험을 위한 전체 샘플 준비 및 데이터 처리 절차에 이미 경험이 있다고 가정하고 고온과 관련된 측면을 강조합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜의 1단계에서 원심분리기 튜브가 잘 설치되었고 실험이 진행 중일 때 떨어지지 않는지 확인하십시오. 챔버에 많은 수의 물방울이 축적되어 여과지의 흡착 용량을 변경할 수 있기 때문에 유리화 장치 챔버가 평형 온도에 도달 한 후 실험의 전체 시간이 30 분을 초과하지 않는 것이 좋습니다. 작동 시간이 30분을 초과하면 작업자는 여과지를 교체하고 캐빈이 온도와 습도의 균형을 다시 맞출…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 유용한 조언을 해준 Thermo Fisher Scientific의 Hervé Remigy 박사에게 감사드립니다. Cryo-EM 실험은 Academia Sinica Cryo-EM Facility(ASCEM)에서 수행되었습니다. ASCEM은 Academia Sinica(Grant No. AS-CFII-108-110) 및 대만 단백질 프로젝트 (보조금 번호. AS-KPQ-109-TPP2). 저자는 또한 샘플 준비에 도움을 준 Ms. Hui-Ju Huang에게 감사를 표합니다.
Materials
| Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
| Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | water bath | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
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