Preparação de grades de amostras de alta temperatura para crio-EM
Summary
Este artigo fornece um protocolo detalhado para a preparação de grades de amostras a temperaturas tão altas quanto 70 °C, antes do congelamento por imersão para experimentos de crio-EM.
Abstract
As grades de amostras para experimentos de microscopia crioeletrônica (crio-EM) são geralmente preparadas a uma temperatura ideal para o armazenamento de amostras biológicas, principalmente a 4 °C e, ocasionalmente, à temperatura ambiente. Recentemente, descobrimos que a estrutura proteica resolvida a baixa temperatura pode não ser funcionalmente relevante, particularmente para proteínas de archaea termofílicas. Um procedimento foi desenvolvido para preparar amostras de proteína em temperaturas mais altas (até 70 °C) para análise crio-EM. Mostramos que as estruturas de amostras preparadas em temperaturas mais altas são funcionalmente relevantes e dependentes da temperatura. Aqui descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de grades de amostras em alta temperatura, usando 55 °C como exemplo. O experimento utilizou um aparelho de vitrificação modificado com um tubo de centrífuga adicional, e as amostras foram incubadas a 55 °C. Os procedimentos detalhados foram ajustados para minimizar a condensação de vapor e obter uma fina camada de gelo na grade. Exemplos de experimentos bem-sucedidos e malsucedidos são fornecidos.
Introduction
A tecnologia crio-EM para a resolução das estruturas de complexos proteicos tem continuado a melhorar, particularmente no sentido da obtenção de estruturas de alta resolução 1,2. Nesse ínterim, o cenário de sua aplicação também foi ampliado pela variação das condições da amostra, como pH ou ligantes, antes do processo de vitrificação3, que envolve a preparação de grades de amostra seguidas de congelamento por imersão 4,5. Outra condição importante é a temperatura. Embora os experimentos de crio-EM, como a cristalografia de raios-X, sejam realizados a baixas temperaturas, a estrutura resolvida pela crio-EM reflete a estrutura no estado da solução antes da vitrificação. Até recentemente, a maioria dos estudos de crio-EM de análise de partícula única (SPA) usa amostras que são mantidas no gelo (ou seja, a 4 °C) antes da vitrificação6, embora vários estudos usem amostras em torno da temperatura ambiente 7,8,9,10 ou tão alto quanto 42 °C 11. Em um relatório recente, realizamos estudos dependentes da temperatura da enzima reducionoisorase cetola-ácida (KARI) do arqueão termofílico Sulfolobus solfataricus (Sso) em seis temperaturas diferentes de 4 °C a 70 °C12. Nossos estudos sugerem que é importante preparar grades de amostras a temperaturas funcionalmente relevantes e que o crio-EM é o único método estrutural praticamente viável para resolver a estrutura do mesmo complexo proteico em múltiplas temperaturas.
A maior dificuldade para a vitrificação em altas temperaturas é minimizar a condensação de vapor e alcançar gelo fino. Aqui relatamos o protocolo detalhado usado para preparar grades de amostras em altas temperaturas em nosso estudo anterior do Sso-KARI 12. Assumimos que os leitores ou espectadores já são experientes nos procedimentos gerais de preparação de amostras e processamento de dados para experimentos de crio-EM e enfatizamos os aspectos relevantes para a alta temperatura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Na etapa 1 do protocolo, certifique-se de que o tubo de centrífuga foi bem instalado e não cai quando o experimento está em andamento. Devido ao acúmulo de um grande número de gotículas de água na câmara, o que poderia alterar a capacidade de adsorção do papel de filtro, recomenda-se que o tempo total do experimento não exceda 30 min após a câmara do aparelho de vitrificação atingir a temperatura de equilíbrio. Se o tempo de operação exceder 30 min, o operador precisa substituir o papel de filtro e espe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Dr. Hervé Remigy da Thermo Fisher Scientific por conselhos úteis. Os experimentos de crio-EM foram realizados na Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). A ASCEM é apoiada pela Academia Sinica (Grant No. AS-CFII-108-110) e Taiwan Protein Project (Grant No. AS-KPQ-109-TPP2). Os autores também agradecem à Sra. Hui-Ju Huang pela assistência na preparação da amostra.
Materials
| Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
| Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | water bath | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
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