Este protocolo descreve a quantificação de variações hemodinâmicas cerebrais volumosas no cérebro do camundongo usando ultrassom funcional (fUS). Procedimentos para mapa de ativação funcional 3D após estimulação sensorial, bem como conectividade funcional de estado de repouso são fornecidos como exemplos ilustrativos, em camundongos anestesiados e acordados.
A imagem de ultrassom funcional (fUS) é uma nova modalidade de imagem cerebral que se baseia na medida de alta sensibilidade do volume sanguíneo cerebral alcançado pela angiografia doppler ultrarrápida. Como a perfusão cerebral está fortemente ligada à atividade neuronal local, essa técnica permite o mapeamento 3D do cérebro inteiro da ativação regional induzida por tarefas, bem como conectividade funcional de estado de repouso, não invasivamente, com resolução spatio-temporal incomparável e simplicidade operacional. Em comparação com a ressonância magnética (ressonância magnética funcional), uma das principais vantagens da imagem fUS consiste em permitir uma compatibilidade completa com experimentos animais acordados e comportados. Além disso, o mapeamento cerebral de ressonância magnética em camundongos, o modelo pré-clínico mais utilizado na Neurociência, permanece tecnicamente desafiador devido ao pequeno tamanho do cérebro e à dificuldade de manter condições fisiológicas estáveis. Aqui apresentamos um protocolo simples, confiável e robusto para imagens de fUS cérebro inteiro em camundongos anestesiados e acordados usando um sistema fUS comercial fora da prateleira com um transdutor linear motorizado, produzindo ativação cortical significativa após estimulação sensorial, bem como padrão de conectividade funcional 3D reprodutível para identificação de rede.
Nas últimas duas décadas, a neuroimagem tornou-se uma importante ferramenta para estudar a função e a organização do cérebro, permitindo que os pesquisadores façam descobertas importantes no campo da neurociência. Hoje, a ressonância magnética funcional (fMRI) tornou-se a técnica de neuroimagem clínica padrão ouro para avaliar tarefa ou ativação cerebral evocada por drogas e mapear a conectividade funcional em repouso. Embora o fMRI humano tenha alta confiabilidade e sensibilidade, o fMRI do mouse permanece tecnicamente desafiador por inúmeras razões1. Primeiro, a ressonância magnética tem uma resolução espacial e temporal ruim. O pequeno tamanho do cérebro do camundongo requer o uso de campos magnéticos fortes usando scanners caros para alcançar uma resolução espacial razoável. Em segundo lugar, manter parâmetros fisiológicos estáveis dentro da faixa estreita permitindo um acoplamento neuro vascular eficiente é muito difícil em camundongos anestesiados. Finalmente, o sinal dependente do nível de oxigênio no sangue (BOLD) no qual os estudos de ressonância magnética dependem tem sensibilidade relativamente ruim, levando a baixa relação sinal-ruído quando aplicado a camundongos e muitas vezes requer apresentação repetida de estímulos durante a aquisição longa para detectar pequenas variações. Sendo o camundongo o modelo animal mais utilizado em pesquisas biomédicas pré-clínicas, essas limitações são parcialmente responsáveis pela lacuna translacional na neuropsiquiatria, dificultando que novos alvos terapêuticos promissores no banco sejam transpostos em tratamentos eficazes ao lado da cama.
Ultrassom funcional (fUS) é uma técnica de neuroimagem recentemente desenvolvida baseada em dopplerultrarrápido 2. Ao amostrar diretamente o volume sanguíneo cerebral, esta técnica permite sondar a atividade cerebral em tempo real através do acoplamento neurovascular. Em comparação com outras técnicas de neuroimagem, a FUS produz uma resolução espacial de 100 μm e uma resolução temporal nas dezenas de milissegundos. Esta técnica permite imagens cerebrais inteiras de seções coronais completas do cérebro do camundongo, completamente não invasivamente. Além disso, é totalmente compatível com animais conscientes e comportados3,4,5. Uma das principais limitações atuais do fUS é o seu recurso 2D, permitindo gravar um único plano coronal ao mesmo tempo. Embora o fUS 3D volumoso usando transdutores de matriz 2D já tenha sido demonstrado com sucesso em ratos6 e confirmado em camundongos7, sua atual falta de sensibilidade requer uma craniotomia completa, bem como uma média de um número importante de ensaios para detectar uma ligeira mudança de atividade. Alternativamente, transdutores lineares podem ser pisados em várias posições e realizar imagens funcionais plano por plano para cobrir todo o cérebro. No entanto, essa técnica requer inúmeras repetições de paradigma experimentais e, como esses longos tempos de aquisição (3-4 horas para o cérebro do camundongo)8,9.
No presente trabalho, descrevemos uma plataforma experimental robusta, incluindo um scanner de ultrassom funcional comercialmente disponível e um transdutor linear de mudança de avião rápido com procedimentos para adquirir dados fUS 3D em camundongos anestesiados e acordados, permitindo mapeamento funcional volumétrico e transcranário do cérebro do camundongo, não invasivamente, sem agente de contraste e em curtos tempos de aquisição. Ilustramos esse recurso mapeando a ativação do córtex somatosensorial após a estimulação do bigode, bem como a conectividade funcional de estado de repouso. Além da preparação animal e coleta de dados, descrevemos também o procedimento de visualização, registro de atlas e análise de sinais fUS em tempo real.
Métodos de imagem cerebral inteiros são ferramentas cruciais para entender melhor a fisiologia cerebral e a patologia. O método descrito aqui permite a quantificação precisa de sinais hemodinâmicos no cérebro vivo diretamente no banco. A sensibilidade incomparável e a resolução espátula-temporal do ultrassom funcional é particularmente adequada para a fisiologia do camundongo. Respostas funcionais e redes de estado de repouso podem ser mapeadas em curtos tempos de aquisição, longitudinalmente e sem ter que fazer testes ou sujeitos médios para obter uma medida confiável. A combinação relevante de sondas lineares ultrassônicas de alta sensibilidade e configurações motorizadas rápidas permite realizar imagens fUS volumétricas transcranais em camundongos dentro de tempos razoáveis de aquisição. Este protocolo pode ser realizado em camundongos anestesiados ou acordados usando uma gaiola doméstica móvel.
A estimulação do whisker, o estímulo sensorial usado como exemplo ilustrativo neste manuscrito, é um paradigma de ativação funcional padrão em roedores e uma leitura confiável para estudar o processamento sensorial, o acoplamento neurovascular e suas alterações5,6,10,11. Embora a escovação manual grosseira dos bigodes possa ser preferida por sua facilidade de uso, este método carece de precisão espacial e temporal. O uso de um estimulador automático, como o descrito aqui acionado com o scanner de imagem fUS, permite um melhor controle de vários parâmetros, incluindo o tempo de início, o deslocamento da amplitude, a frequência, bem como o ângulo da ponta Q/pente, resultando em uma melhor reprodutibilidade entre animais. Além disso, um tempo mais preciso de estimulação permite a modelagem da Função de Resposta Hemodinâmica (HRF) determinando o tempo de início e o tempo para os parâmetros de pico12,13. Para garantir melhor precisão no número de bigodes desviados durante a estimulação (e, portanto, na área da região ativada), estimuladores mais sofisticados podem ser adaptados a este protocolo. Muitos outros estímulos como luz8,som14 ou apresentação de odor15 podem ser implementados usando o mesmo protocolo.
A compatibilidade do ultrassom funcional com animais acordados e comportados é uma vantagem importante em relação a outras técnicas de neuroimagem, permitindo o mapeamento de ativação funcional sem o viés da anestesia. O uso de uma base doméstica móvel levantada a ar é uma boa alternativa para outros aparelhos fixos na cabeça existentes, como esteiras lineares ou esféricas. Ao ser firmemente fixado na cabeça, o movimento da base dá ao mouse a ilusão de navegar pelo ambiente, permitindo que uma ampla gama de testes comportamentais seja acoplado à imagem fUS16. No entanto, o procedimento de habitação para fixação da cabeça constitui um passo importante para diminuir o estresse, especialmente para experimentos onde pode ser considerado um fator de confusão. O procedimento aqui detalhado (6 dias de manuseio e habituação à fixação da cabeça) dá resultados robustos para estimulação sensorial e conectividade funcional de estado de repouso. No entanto, pode ser necessário estender o período de habituação para testes comportamentais mais refinados17.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo European Research Council (ERC) Advanced Grant N° 339244-FUSIMAGINE, a Agência Nacional de Pesquisa financiando ‘Pinch’ (ANR-18-CE37-005), o Inserm Research Technology Accelerator in Biomedical Ultrasound, o núcleo técnico do IPNP, o Inserm U1266, o programa europeu de pesquisa FUSIMICE do Projeto Cérebro Humano, e a EmBO Short-Term Fellowship 8439 para Andrea Kliewer.
BD Plastipak 1 mL syringes | Dutscher, France | 303172 | |
BD Microlance 26 Gauge needles | Dutscher, France | 303800 | |
Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe) | Physitemp | TCAT-2DF | |
Arduino | Arduino | Arduino Uno-Rev3 | |
Atipamezole | Orion Pharma, France | Antisedan® | 5 mg/ml injectable solution |
Dental Ciment | Sun Médical, Shiga, japan | Superbond C&B | |
Depilatory cream | Klorane | N/A | |
Eye Ointment | TVM, UK | Ocry-gel | |
Hair trimmer | Wella Profesionnals | N/A | |
Head plates | Neurotar, Finland | Model 14 | |
Iconeus One standard package for fUS | Iconeus, France | Iconeus One | |
IcoScan acquisition software (v1.0) | Iconeus, France | IcoScan | |
IcoStudio analysis software (v1.0) | Iconeus, France | IcoStudio | |
Isoflurane Anesthesia station | Minerve, Esternay, France | ||
Ketamine | Virbac, France | Ketamine1000 | 100 mg/ml injectable solution |
Lidocaine | Vetoquinol | Lurocaine® | 20 mg/ml injectable solution |
Medetomidine | Orion Pharma, France | Domitor® | 1 mg/ml injectable solution |
Meloxicam | Boehringer lingelheim | Metacam® | 0.5 mg/ml injectable solution |
Mobile HomeCage Large with tracking capability | Neurotar, Finland | MHC-L-T-V4 | |
Monitoring of ECG and breathing rate | AD Systems, (USA) and LabChart software | ||
Servomotor | Feetech | FT90B | |
Stereotaxic frame | David Kopf (Tujunga, USA) | 900-WA | Using Mouse Adaptor (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922) |
Surgical glue | 3M, USA | Vetbond | |
Syringe Pump | KD Scientific, USA | Legato® 130, Cat# 788130 | |
Ultrasound gel | DREXCO medical, France | Medi'Gel | |
Xylazine 2% | Bayer, France | Rompun® | 20 mg/ml injectable solution |