Attivazione 3D dell'intero cervello e mappatura della connettività funzionale nei topi utilizzando l'imaging ecografico funzionale transcraniale
Summary
Questo protocollo descrive la quantificazione delle variazioni emodinamiche cerebrali volumetriche nel cervello del topo utilizzando l’ecografia funzionale (fUS). Le procedure per la mappa di attivazione funzionale 3D dopo la stimolazione sensoriale e la connettività funzionale dello stato di riposo sono fornite come esempi illustrativi, in topi anestetizzati e svegli.
Abstract
L’imaging a ultrasuoni funzionali (fUS) è una nuova modalità di imaging cerebrale che si basa sulla misura ad alta sensibilità del volume di sangue cerebrale raggiunta dall’angiografia doppler ultraveloce. Poiché la perfusione cerebrale è fortemente legata all’attività neuronale locale, questa tecnica consente la mappatura 3D dell’intero cervello dell’attivazione regionale indotta dal compito e la connettività funzionale dello stato di riposo, in modo non invasivo, con una risoluzione spazio-temporale senza pari e semplicità operativa. Rispetto alla fMRI (risonanza magnetica funzionale), uno dei principali vantaggi dell’imaging fUS consiste nel consentire una completa compatibilità con gli esperimenti sugli animali svegli e comportati. Inoltre, la mappatura cerebrale fMRI nei topi, il modello preclinico più utilizzato nelle Neuroscienze, rimane tecnicamente impegnativa a causa delle piccole dimensioni del cervello e della difficoltà di mantenere condizioni fisiologiche stabili. Qui presentiamo un protocollo semplice, affidabile e robusto per l’imaging fUS dell’intero cervello in topi anestetizzati e svegli utilizzando un sistema fUS commerciale pronto all’uso con un trasduttore lineare motorizzato, che produce una significativa attivazione corticale dopo la stimolazione sensoriale e un modello di connettività funzionale 3D riproducibile per l’identificazione della rete.
Introduction
Negli ultimi due decenni, il neuroimaging è diventato uno strumento importante per studiare la funzione e l’organizzazione del cervello, consentendo ai ricercatori di fare importanti scoperte nel campo delle neuroscienze. Oggi, la risonanza magnetica funzionale (fMRI) è diventata la tecnica di neuroimaging clinico gold standard per valutare l’attivazione cerebrale evocata da compiti o farmaci e per mappare la connettività funzionale a riposo. Mentre la fMRI umana ha un’elevata affidabilità e sensibilità, la fMRI del mouse rimane tecnicamente impegnativa per numerose ragioni1. In primo luogo, la fMRI ha una scarsa risoluzione spaziale e temporale. Le piccole dimensioni del cervello del topo richiedono l’uso di forti campi magnetici utilizzando costosi scanner per ottenere una risoluzione spaziale ragionevole. In secondo luogo, mantenere parametri fisiologici stabili all’interno della gamma ristretta che consente un efficiente accoppiamento neuro-vascolare è molto difficile nei topi anestetizzati. Infine, il segnale dipendente dal livello di ossigeno nel sangue (BOLD) su cui si basano gli studi fMRI ha una sensibilità relativamente scarsa, che porta a un basso rapporto segnale-rumore quando applicato ai topi e spesso richiede una presentazione ripetuta dello stimolo su una lunga acquisizione per rilevare piccole variazioni. Essendo il topo il modello animale più utilizzato nella ricerca preclinica biomedica, queste limitazioni sono in parte responsabili del divario traslazionale nella neuropsichiatria, impedendo la trasposizione di nuovi promettenti bersagli terapeutici sul banco in trattamenti efficaci al capezzale.
L’ecografia funzionale (fUS) è una tecnica di neuroimaging di recente sviluppo basata sul doppler ultraveloce2. Campionando direttamente il volume del sangue cerebrale, questa tecnica consente di sondare l’attività cerebrale in tempo reale attraverso l’accoppiamento neurovascolare. Rispetto ad altre tecniche di neuroimaging, fUS produce una risoluzione spaziale di 100 μm e una risoluzione temporale nelle decine di millisecondi. Questa tecnica consente l’imaging dell’intero cervello di sezioni coronali complete del cervello del topo, completamente non invasivamente. Inoltre, è pienamente compatibile con animali coscienti e che si comportano3,4,5. Una delle principali limitazioni attuali di fUS è la sua funzione 2D, che consente di registrare un singolo piano coronale allo stesso tempo. Mentre la fUS volumetrica 3D che utilizza trasduttori array a matrice di matrice 2D è già stata dimostrata con successo nei ratti6 e confermata nei topi7,la sua attuale mancanza di sensibilità richiede una craniotomia completa e una media di un numero importante di studi per rilevare un leggero cambiamento di attività. In alternativa, i trasduttori lineari possono essere calpestati in più posizioni ed eseguire l’imaging funzionale piano per piano per coprire l’intero cervello. Tuttavia, questa tecnica richiede numerose ripetizioni del paradigma sperimentale e come tali lunghi tempi di acquisizione (3-4 ore per il cervello del topo)8,9.
Nel presente lavoro, descriviamo una solida piattaforma sperimentale che include uno scanner ad ultrasuoni funzionale disponibile in commercio e un trasduttore lineare a commutazione di piano veloce con procedure per acquisire dati fUS 3D in topi anestetizzati e svegli, consentendo la mappatura funzionale volumetrica e transcraziale del cervello del topo, in modo non invasivo, senza mezzo di contrasto e in brevi tempi di acquisizione. Illustriamo questa caratteristica mappando l’attivazione della corteccia somatosensoriale dopo la stimolazione dei baffi e la connettività funzionale dello stato di riposo. Oltre alla preparazione degli animali e alla raccolta dei dati, descriviamo anche la procedura per la visualizzazione, la registrazione dell’atlante e l’analisi dei segnali fUS in tempo reale.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi di imaging dell’intero cervello sono strumenti cruciali per comprendere meglio la fisiologia e la patologia del cervello. Il metodo qui descritto consente la quantificazione precisa dei segnali emodinamici nel cervello vivente direttamente al banco. La sensibilità e la risoluzione spazio-temporale senza pari degli ultrasuoni funzionali sono particolarmente adatte per la fisiologia del topo. Le risposte funzionali e le reti a stato di riposo possono essere mappate in tempi di acquisizione brevi, longitudinalmente e senza dover mediare studi o soggetti per ottenere una misura affidabile. La combinazione pertinente di sonde lineari ad ultrasuoni ad alta sensibilità e configurazioni motorizzate veloci consente di eseguire l’imaging fUS volumetrico transcraniale nei topi entro tempi di acquisizione ragionevoli. Questo protocollo può essere eseguito su topi anestetizzati o svegli utilizzando una gabbia per case mobili.
La stimolazione dei baffi, lo stimolo sensoriale usato come esempio illustrativo in questo manoscritto, è un paradigma di attivazione funzionale standard nei roditori e una lettura affidabile per studiare l’elaborazione sensoriale, l’accoppiamento neurovascolare e le loro alterazioni5,6,10,11. Mentre la spazzolatura manuale grossolana dei baffi può essere preferita per la sua facilità d’uso, questo metodo manca di precisione spaziale e temporale. L’utilizzo di uno stimolatore automatico, come quello qui descritto attivato con lo scanner di imaging fUS, consente un migliore controllo di diversi parametri tra cui il tempo di insorgenza, lo spostamento di ampiezza, la frequenza e l’angolo del Q-tip/pettine, con conseguente migliore riproducibilità tra animali. Inoltre, una tempistica più precisa della stimolazione consente la modellazione della funzione di risposta emodinamica (HRF) determinando il tempo di insorgenza e il tempo di picco dei parametri12,13. Per garantire una migliore precisione sul numero di baffi deviati durante la stimolazione (e quindi sull’area della regione attivata), stimolatori più sofisticati possono essere adattati a questo protocollo. Molti altri stimoli come la luce8, il suono14 o la presentazione degli odori15 possono essere implementati utilizzando lo stesso protocollo.
La compatibilità dell’ecografia funzionale con animali svegli e che si comportano è un vantaggio importante rispetto ad altre tecniche di neuroimaging, consentendo la mappatura dell’attivazione funzionale senza il bias dell’anestesia. L’utilizzo di una forca mobile sollevata ad aria è una buona alternativa ad altri apparecchi fissi esistenti come tapis roulant lineari o sferici. Pur essendo saldamente fissato a testa, il movimento dell’homecage dà al mouse l’illusione di navigare nell’ambiente, consentendo di accoppiare una vasta gamma di test comportamentali all’imaging fUS16. Tuttavia, la procedura di assuefazione al fissaggio della testa costituisce un passo importante per ridurre lo stress, soprattutto per gli esperimenti in cui può essere considerato un fattore confondente. La procedura descritta qui (6 giorni di manipolazione e assuefazione alla fissazione della testa) fornisce risultati robusti per la stimolazione sensoriale e la connettività funzionale dello stato di riposo. Tuttavia, potrebbe essere necessario estendere il periodo di assuefazione per test comportamentali più raffinati17.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dall’European Research Council (ERC) Advanced Grant N° 339244-FUSIMAGINE, dall’Agenzia Nazionale per il Finanziamento della Ricerca ‘Pinch’ (ANR-18-CE37-005), dall’Inserm Research Technology Accelerator in Biomedical Ultrasound, dal nucleo tecnico ElfUS dell’IPNP, dall’Inserm U1266, dal programma di ricerca europeo FUSIMICE del Human Brain Project e dalla EMBO Short-Term Fellowship 8439 ad Andrea Kliewer.
Materials
| BD Plastipak 1 mL syringes | Dutscher, France | 303172 | |
| BD Microlance 26 Gauge needles | Dutscher, France | 303800 | |
| Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe) | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Arduino | Arduino | Arduino Uno-Rev3 | |
| Atipamezole | Orion Pharma, France | Antisedan® | 5 mg/ml injectable solution |
| Dental Ciment | Sun Médical, Shiga, japan | Superbond C&B | |
| Depilatory cream | Klorane | N/A | |
| Eye Ointment | TVM, UK | Ocry-gel | |
| Hair trimmer | Wella Profesionnals | N/A | |
| Head plates | Neurotar, Finland | Model 14 | |
| Iconeus One standard package for fUS | Iconeus, France | Iconeus One | |
| IcoScan acquisition software (v1.0) | Iconeus, France | IcoScan | |
| IcoStudio analysis software (v1.0) | Iconeus, France | IcoStudio | |
| Isoflurane Anesthesia station | Minerve, Esternay, France | ||
| Ketamine | Virbac, France | Ketamine1000 | 100 mg/ml injectable solution |
| Lidocaine | Vetoquinol | Lurocaine® | 20 mg/ml injectable solution |
| Medetomidine | Orion Pharma, France | Domitor® | 1 mg/ml injectable solution |
| Meloxicam | Boehringer lingelheim | Metacam® | 0.5 mg/ml injectable solution |
| Mobile HomeCage Large with tracking capability | Neurotar, Finland | MHC-L-T-V4 | |
| Monitoring of ECG and breathing rate | AD Systems, (USA) and LabChart software | ||
| Servomotor | Feetech | FT90B | |
| Stereotaxic frame | David Kopf (Tujunga, USA) | 900-WA | Using Mouse Adaptor (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922) |
| Surgical glue | 3M, USA | Vetbond | |
| Syringe Pump | KD Scientific, USA | Legato® 130, Cat# 788130 | |
| Ultrasound gel | DREXCO medical, France | Medi'Gel | |
| Xylazine 2% | Bayer, France | Rompun® | 20 mg/ml injectable solution |
References
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