Whole-Brain 3D-activering en functionele connectiviteit mapping bij muizen met behulp van transcraniële functionele echografie beeldvorming
Summary
Dit protocol beschrijft de kwantificering van volumetrische cerebrale hemodynamische variaties in het muizenbrein met behulp van functionele echografie (fUS). Procedures voor 3D functionele activeringskaart na sensorische stimulatie en functionele connectiviteit in rusttoestand worden gegeven als illustratieve voorbeelden, bij verdoofde en wakkere muizen.
Abstract
Functionele echografie (fUS) beeldvorming is een nieuwe beeldvormingsmodaliteit van de hersenen die afhankelijk is van de hoogsensitiviteitsmaat van het cerebrale bloedvolume dat wordt bereikt door ultrasnelle dopplerangiografie. Omdat hersenperfusie sterk verbonden is met lokale neuronale activiteit, maakt deze techniek het mogelijk om de hele hersenen 3D-mapping van taakgeïnduceerde regionale activering en functionele connectiviteit in rusttoestand, niet-invasief, met ongeëvenaarde spatio-temporele resolutie en operationele eenvoud. In vergelijking met fMRI (functional magnetic resonance imaging) bestaat een belangrijk voordeel van fUS imaging uit het mogelijk maken van een volledige compatibiliteit met wakkere en zich gedragende dierproeven. Bovendien blijft fMRI brain mapping bij muizen, het meest gebruikte preklinische model in de neurowetenschappen, technisch uitdagend vanwege de kleine omvang van de hersenen en de moeilijkheid om stabiele fysiologische omstandigheden te behouden. Hier presenteren we een eenvoudig, betrouwbaar en robuust protocol voor fUS-beeldvorming van de hele hersenen bij verdoofde en wakkere muizen met behulp van een kant-en-klaar commercieel fUS-systeem met een gemotoriseerde lineaire transducer, wat aanzienlijke corticale activering oplevert na sensorische stimulatie en reproduceerbaar 3D functioneel connectiviteitspatroon voor netwerkidentificatie.
Introduction
In de afgelopen twee decennia is neuroimaging een belangrijk hulpmiddel geworden voor het bestuderen van hersenfunctie en -organisatie, waardoor onderzoekers belangrijke ontdekkingen kunnen doen op het gebied van neurowetenschappen. Tegenwoordig is functionele magnetische resonantie beeldvorming (fMRI) de gouden standaard klinische neuroimaging-techniek geworden om taak- of geneesmiddel-opgeroepen hersenactivatie te beoordelen en functionele connectiviteit in rust in kaart te brengen. Hoewel menselijke fMRI een hoge betrouwbaarheid en gevoeligheid heeft, blijft muis fMRI om verschillende redenen technisch uitdagend1. Ten eerste heeft fMRI een slechte ruimtelijke en temporele resolutie. De kleine omvang van het muizenbrein vereist het gebruik van sterke magnetische velden met behulp van dure scanners om een redelijke ruimtelijke resolutie te bereiken. Ten tweede is het handhaven van stabiele fysiologische parameters binnen het smalle bereik waardoor efficiënte neuro-vasculaire koppeling mogelijk is, erg moeilijk bij verdoofde muizen. Ten slotte heeft het bloedzuurstofniveauafhankelijke (BOLD) signaal waarop fMRI-studies vertrouwen een relatief slechte gevoeligheid, wat leidt tot een lage signaal-ruisverhouding wanneer toegepast op muizen en vaak herhaalde stimuluspresentatie gedurende lange acquisitie vereist om kleine variaties te detecteren. Omdat de muis het meest gebruikte diermodel is in biomedisch preklinisch onderzoek, zijn deze beperkingen deels verantwoordelijk voor de translationele kloof in de neuropsychiatrie, waardoor nieuwe veelbelovende therapeutische doelen op de bank kunnen worden omgezet in effectieve behandelingen aan het bed.
Functionele echografie (fUS) is een recent ontwikkelde neuroimaging techniek op basis van ultrasnelle doppler2. Door direct het cerebrale bloedvolume te bemonsteren, maakt deze techniek het mogelijk om hersenactiviteit in realtime te onderzoeken via de neurovasculaire koppeling. In vergelijking met andere neuroimaging-technieken levert fUS een ruimtelijke resolutie op van 100 μm en een temporele resolutie in de tientallen milliseconden. Deze techniek maakt beeldvorming van de hele hersenen mogelijk van volledige coronale delen van het muizenbrein, volledig niet-invasief. Bovendien is het volledig compatibel met bewuste en zich gedragende dieren3,4,5. Een van de belangrijkste huidige beperkingen van fUS is de 2D-functie, waardoor tegelijkertijd een enkel coronaal vlak kan worden opgenomen. Hoewel volumetrische 3D fUS met behulp van 2D matrix array transducers al met succes is aangetoond bij ratten6 en bevestigd bij muizen7,vereist het huidige gebrek aan gevoeligheid een volledige craniotomie en een gemiddeld aantal onderzoeken om een lichte verandering van activiteit te detecteren. Als alternatief kunnen lineaire transducers over meerdere posities worden getrapt en functionele beeldvorming vlak voor vliegtuig uitvoeren om de hele hersenen te bedekken. Deze techniek vereist echter tal van experimentele paradigmaherhalingen en als zodanig lange acquisitietijden (3-4 uur voor het muizenbrein)8,9.
In het huidige werk beschrijven we een robuust experimenteel platform, waaronder een commercieel beschikbare functionele ultrasone scanner en een snelle vlak-schakelende lineaire transducer met procedures om 3D fUS-gegevens te verkrijgen in verdoofde en wakkere muizen, waardoor volumetrische en transcraniële functionele mapping van de muizenhersenen mogelijk is, niet-invasief, zonder contrastmiddel en binnen korte acquisitietijden. We illustreren deze functie door somatosensorische cortexactivatie na snorrestimulatie en functionele connectiviteit in rusttoestand in kaart te brengen. Naast diervoorbereiding en gegevensverzameling beschrijven we ook de procedure voor visualisatie, atlasregistratie en analyse van real-time fUS-signalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beeldvormingsmethoden voor de hele hersenen zijn cruciale hulpmiddelen om de hersenfysiologie en pathologie beter te begrijpen. De hier beschreven methode maakt de nauwkeurige kwantificering van hemodynamische signalen in het levende brein direct op de bank mogelijk. De ongeëvenaarde gevoeligheid en spatio-temporele resolutie van functionele echografie is bijzonder geschikt voor de fysiologie van de muis. Functionele responsen en rusttoestandnetwerken kunnen binnen korte acquisitietijden in kaart worden gebracht, longitudinaal en zonder dat er gemiddeld proeven of proefpersonen hoeven te worden uitgevoerd om een betrouwbare meting te verkrijgen. De relevante combinatie van ultrasoon lineaire sondes met hoge gevoeligheid en snelle gemotoriseerde opstellingen stelt iemand in staat om transcraniële volumetrische fUS-beeldvorming bij muizen uit te voeren binnen redelijke acquisitietijden. Dit protocol kan worden uitgevoerd op verdoofde of wakkere muizen met behulp van een kooi voor stacaravans.
Whisker-stimulatie, de sensorische stimulus die in dit manuscript als illustratief voorbeeld wordt gebruikt, is een standaard functioneel activeringsparadigma bij knaagdieren en een betrouwbare uitlezing om sensorische verwerking, neurovasculaire koppeling en hun veranderingen5,6,10,11te bestuderen. Hoewel grof handmatig borstelen van de snorharen de voorkeur kan hebben vanwege het gebruiksgemak, mist deze methode ruimtelijke en temporele precisie. Het gebruik van een automatische stimulator, zoals die hier wordt beschreven, geactiveerd met de fUS-beeldvormingsscanner, zorgt voor een betere controle van verschillende parameters, waaronder het tijdstip van aanvang, de amplitudeverplaatsing, de frequentie en de hoek van de Q-tip / kam, wat resulteert in een betere reproduceerbaarheid tussen dieren. Bovendien maakt een nauwkeurigere timing van stimulatie de modellering van de hemodynamische responsfunctie (HRF) mogelijk door de tijd tot aanvang en de tijd tot piekparameters te bepalen12,13. Om een betere precisie te garanderen op het aantal snorharen dat tijdens de stimulatie wordt afgebogen (en dus het gebied van het geactiveerde gebied), kunnen meer geavanceerde stimulatoren aan dit protocol worden aangepast. Veel andere stimuli zoals licht8,geluid14 of geurpresentatie15 kunnen met hetzelfde protocol worden geïmplementeerd.
De compatibiliteit van functionele echografie met wakkere en zich gedragende dieren is een belangrijk voordeel in vergelijking met andere neuroimaging-technieken, waardoor functionele activeringskartering mogelijk is zonder de anesthesiebias. Het gebruik van een luchtgelifte stacaravan is een goed alternatief voor andere bestaande hoofdvaste apparaten zoals lineaire of bolvormige loopbanden. Hoewel de beweging van de homecage stevig op het hoofd is, geeft het de muis de illusie om door de omgeving te navigeren, waardoor een breed scala aan gedragstests kan worden gekoppeld aan fUS-beeldvorming16. De gewenningsprocedure voor hoofdfixatie is echter een belangrijke stap om stress te verminderen, vooral voor experimenten waarbij het als een verstorende factor kan worden beschouwd. De hier beschreven procedure (6 dagen hanteren en gewenning aan hoofdfixatie) geeft robuuste resultaten voor sensorische stimulatie en functionele connectiviteit in rusttoestand. Het kan echter nodig zijn om de gewenningsperiode te verlengen voor meer verfijnde gedragstests17.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de European Research Council (ERC) Advanced Grant N° 339244-FUSIMAGINE, het National Agency for Research funding ‘Pinch’ (ANR-18-CE37-005), de Inserm Research Technology Accelerator in Biomedical Ultrasound, de ElfUS technische kern van de IPNP, Inserm U1266, het Europese onderzoeksprogramma FUSIMICE van het Human Brain Project en EMBO Short-Term Fellowship 8439 aan Andrea Kliewer.
Materials
| BD Plastipak 1 mL syringes | Dutscher, France | 303172 | |
| BD Microlance 26 Gauge needles | Dutscher, France | 303800 | |
| Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe) | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Arduino | Arduino | Arduino Uno-Rev3 | |
| Atipamezole | Orion Pharma, France | Antisedan® | 5 mg/ml injectable solution |
| Dental Ciment | Sun Médical, Shiga, japan | Superbond C&B | |
| Depilatory cream | Klorane | N/A | |
| Eye Ointment | TVM, UK | Ocry-gel | |
| Hair trimmer | Wella Profesionnals | N/A | |
| Head plates | Neurotar, Finland | Model 14 | |
| Iconeus One standard package for fUS | Iconeus, France | Iconeus One | |
| IcoScan acquisition software (v1.0) | Iconeus, France | IcoScan | |
| IcoStudio analysis software (v1.0) | Iconeus, France | IcoStudio | |
| Isoflurane Anesthesia station | Minerve, Esternay, France | ||
| Ketamine | Virbac, France | Ketamine1000 | 100 mg/ml injectable solution |
| Lidocaine | Vetoquinol | Lurocaine® | 20 mg/ml injectable solution |
| Medetomidine | Orion Pharma, France | Domitor® | 1 mg/ml injectable solution |
| Meloxicam | Boehringer lingelheim | Metacam® | 0.5 mg/ml injectable solution |
| Mobile HomeCage Large with tracking capability | Neurotar, Finland | MHC-L-T-V4 | |
| Monitoring of ECG and breathing rate | AD Systems, (USA) and LabChart software | ||
| Servomotor | Feetech | FT90B | |
| Stereotaxic frame | David Kopf (Tujunga, USA) | 900-WA | Using Mouse Adaptor (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922) |
| Surgical glue | 3M, USA | Vetbond | |
| Syringe Pump | KD Scientific, USA | Legato® 130, Cat# 788130 | |
| Ultrasound gel | DREXCO medical, France | Medi'Gel | |
| Xylazine 2% | Bayer, France | Rompun® | 20 mg/ml injectable solution |
References
- Hoyer, C., Gass, N., Weber-Fahr, W., Sartorius, A. Advantages and challenges of small animal magnetic resonance imaging as a translational tool. Neuropsychobiology. 69 (4), 187-201 (2014).
- Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art. Current Opinion in Neurobiology. 50, 128-135 (2018).
- Rabut, C., et al. Pharmaco-fUS: Quantification of pharmacologically-induced dynamic changes in brain perfusion and connectivity by functional ultrasound imaging in awake mice. NeuroImage. 222, 117231 (2020).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Ferrier, J., Tiran, E., Deffieux, T., Tanter, M., Lenkei, Z. Functional imaging evidence for task-induced deactivation and disconnection of a major default mode network hub in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (26), 15270-15280 (2020).
- Rabut, C., et al. 4D functional ultrasound imaging of whole-brain activity in rodents. Nature Methods. 16 (10), 994-997 (2019).
- Brunner, C., et al. A platform for brain-wide volumetric functional ultrasound imaging and of circuit dynamics in awake mice. Neuron. 108 (5), 861-875 (2020).
- Gesnik, M., et al. 3D functional ultrasound imaging of the cerebral visual system in rodents. NeuroImage. 149, 267-274 (2017).
- Macé, &. #. 2. 0. 1. ;., et al. Whole-brain functional ultrasound imaging reveals brain modules for visuomotor integration. Neuron. 100 (5), 1241-1251 (2018).
- Macé, E., Montaldo, G., Cohen, I., Baulac, M., Fink, M., Tanter, M. Functional ultrasound imaging of the brain. Nature Methods. 8 (8), 662-664 (2011).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Claron, J., et al. Large scale functional ultrasound imaging of the spinal cord reveals in depth spatiotemporal responses of spinal nociceptive circuits in both normal and inflammatory state. Pain. , (2020).
- Aydin, A. K., et al. Transfer functions linking neural calcium to single voxel functional ultrasound signal. Nature Communications. 11 (1), 2954 (2020).
- Bimbard, C., et al. Multi-scale mapping along the auditory hierarchy using high-resolution functional ultrasound in the awake ferret. eLife. 7, 35028 (2018).
- Boido, D., et al. Mesoscopic and microscopic imaging of sensory responses in the same animal. Nature Communications. 10 (1), 1110 (2019).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: A new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments. (88), e51869 (2014).
- Juczewski, K., Koussa, J. A., Kesner, A. J., Lee, J. O., Lovinger, D. M. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice. Scientific Reports. 10 (1), 12245 (2020).
