Transkraniyal Fonksiyonel Ultrason Görüntüleme Kullanan Farelerde Tüm Beyin 3D Aktivasyon ve Fonksiyonel Bağlantı Haritalaması
Summary
Bu protokol, fonksiyonel ultrason (fUS) kullanarak fare beynindeki hacimsel serebral hemodinamik varyasyonların nicelliğini açıklar. Duyusal stimülasyonun yanı sıra dinlenme durumu fonksiyonel bağlantısını takip eden 3D fonksiyonel aktivasyon haritası prosedürleri, uyuşturulmış ve uyanık farelerde açıklayıcı örnekler olarak sağlanır.
Abstract
Fonksiyonel ultrason (fUS) görüntüleme, ultra hızlı doppler anjiyografi ile elde edilen serebral kan hacminin yüksek hassasiyet ölçüsüne dayanan yeni bir beyin görüntüleme yöntemidir. Beyin perfüzyonu yerel nöronal aktiviteye güçlü bir şekilde bağlı olduğundan, bu teknik, görev kaynaklı bölgesel aktivasyonun tüm beyin 3D haritalandırılmasına ve aynı anda eşsiz mekansal-zamansal çözünürlük ve operasyonel basitlik ile invaziv olmayan dinlenme durumu fonksiyonel bağlantısına izin verir. fMRI (fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme) ile karşılaştırıldığında, fUS görüntülemenin ana avantajı uyanık ve davranışlı hayvan deneyleriyle tam bir uyumluluk sağlamaktır. Ayrıca, Nörobilimde en çok kullanılan preklinik model olan farelerde fMRI beyin haritalaması, beynin küçük boyutu ve istikrarlı fizyolojik koşulları koruma zorluğu nedeniyle teknik olarak zor olmaya devam etmektedir. Burada, motorlu doğrusal dönüştürücülü raf dışı ticari bir fUS sistemi kullanarak uyuşturulmuş ve uyanık farelerde tüm beyin fUS görüntülemesi için basit, güvenilir ve sağlam bir protokol sunuyoruz, duyusal stimülasyonun yanı sıra ağ tanımlaması için tekrarlanabilir 3D fonksiyonel bağlantı desenini takiben önemli kortikal aktivasyon sağlar.
Introduction
Son yirmi yılda, nörogörüntüleme, beyin fonksiyonlarını ve organizasyonunu incelemek için önemli bir araç haline geldi ve araştırmacıların nörobilim alanında önemli keşifler yapmalarını sağladı. Günümüzde fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme (fMRI), görev veya ilaçla uyarılan beyin aktivasyonunu değerlendirmek ve istirahatte fonksiyonel bağlantıyı haritalamak için altın standart klinik nörogörüntleme tekniği haline gelmiştir. İnsan fMRI yüksek güvenilirlik ve duyarlılığa sahip olsa da, fare fMRI teknik olarak çeşitli nedenlerle zorlu olmaya devam eder1. İlk olarak, fMRI zayıf bir mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahiptir. Fare beyninin küçük boyutu, makul uzamsal çözünürlük elde etmek için pahalı tarayıcılar kullanarak güçlü manyetik alanların kullanılmasını gerektirir. İkincisi, etkili nöro-vasküler kavramaya izin vermek için dar aralıkta kararlı fizyolojik parametrelerin korunması anestezik farelerde çok zordur. Son olarak, fMRI çalışmalarının dayandığı kan oksijen seviyesine bağımlı (BOLD) sinyal nispeten zayıf hassasiyete sahiptir, bu da farelere uygulandığında düşük sinyal-gürültü oranına yol açar ve genellikle küçük varyasyonları tespit etmek için uzun alım üzerinde tekrarlanan uyaran sunumu gerektirir. Fare biyomedikal preklinik araştırmalarda en yaygın kullanılan hayvan modelidir, bu sınırlamalar nöropsikiyatrideki çevirisel boşluklardan kısmen sorumludur ve tezgahtaki yeni umut verici terapötik hedeflerin başucunda etkili tedavilere dönüştürülmesine engel olur.
Fonksiyonel ultrason (fUS), ultra hızlı doppler2’yedayanan yakın zamanda geliştirilmiş bir nörogörüntüleme tekniğidir. Serebral kan hacmini doğrudan örneklemekle, bu teknik beyin aktivitesini nörovasküler kavrama yoluyla gerçek zamanlı olarak yoklamayı sağlar. Diğer nörogörüntüleme teknikleriyle karşılaştırıldığında, fUS 100 μm’lik bir mekansal çözünürlük ve onlarca milisaniyede zamansal bir çözünürlük sağlar. Bu teknik, fare beyninin tam koronal bölümlerinin tamamen invaziv olmayan bir şekilde tüm beyinle görüntülenmesini sağlar. Ayrıca, bilinçli ve davranan hayvanlarla tamamen uyumludur3,4,5. FUS’un ana akım sınırlamalarından biri, aynı anda tek bir koronal düzlem kaydetmeye izin sağlayan 2D özelliğidir. 2D matris dizisi dönüştürücüleri kullanan hacimsel 3D fUS zaten sıçanlardabaşarıyla gösterilmiştir 6 ve farelerdeonaylanmıştır 7, mevcut hassasiyet eksikliği tam bir kraniyotomi gerektirir ve hafif bir aktivite değişikliğini tespit etmek için önemli sayıda denemenin ortalamasını gerektirir. Alternatif olarak, doğrusal dönüştürücüler birden fazla konuma basılabilir ve tüm beyni kapsayacak şekilde düzlemle fonksiyonel görüntüleme düzlemi gerçekleştirebilir. Bununla birlikte, bu teknik çok sayıda deneysel paradigma tekrarı gerektirir ve bu kadar uzun alım süreleri (fare beyni için 3-4 saat)8,9.
Mevcut çalışmada, ticari olarak mevcut bir fonksiyonel ultrason tarayıcısı ve uyuşturulmış ve uyanık farelerde 3D fUS verileri elde etme prosedürlerine sahip hızlı bir düzlem değiştiren doğrusal dönüştürücü içeren sağlam bir deneysel platformu tanımlıyoruz, fare beyninin hacimsel ve transkraniyal fonksiyonel haritalandırılmasına izin veriyoruz, invaziv olmayan, kontrast madde olmadan ve kısa alım süreleri içinde. Bu özelliği, bıyık stimülasyonunun yanı sıra dinlenme durumu fonksiyonel bağlantısını takiben somatosensör korteks aktivasyonunu haritalayarak gösteriyoruz. Hayvan hazırlama ve veri toplamanın yanı sıra, gerçek zamanlı fUS sinyallerinin görselleştirilmesi, atlas kaydı ve analizi prosedürünü de açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tüm beyin görüntüleme yöntemleri, beyin fizyolojisini ve patolojisini daha iyi anlamak için çok önemli araçlardır. Burada açıklanan yöntem, canlı beyindeki hemodinamik sinyallerin doğrudan tezgahta hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar. Fonksiyonel ultrasonun eşsiz hassasiyeti ve mekansal-zamansal çözünürlüğü özellikle fare fizyolojisi için çok uygundur. İşlevsel yanıtlar ve dinlenme durumu ağları, uzunlamasına ve güvenilir bir önlem elde etmek için denemeleri veya konuları ortalamaya almak zorunda kalmadan kısa alım süreleri içinde eşlenebilir. Yüksek hassasiyetli ultrasonik lineer problar ve hızlı motorlu kurulumların ilgili kombinasyonu, makul alım süreleri içinde farelerde transkraniyal hacimsel fUS görüntüleme gerçekleştirmesini sağlar. Bu protokol, mobil bir ev kafesi kullanılarak uyuşturulmuş veya uyanık fareler üzerinde gerçekleştirilebilir.
Bu yazıda örnek olarak kullanılan duyusal uyaran olan bıyık stimülasyonu, kemirgenlerde standart bir fonksiyonel aktivasyon paradigmasıdır ve duyusal işleme, nörovasküler kavrama vebunların 5,6,10,11değişikliklerini incelemek için güvenilir bir okumadır. Kullanım kolaylığı için bıyıkların kaba elle fırçalaması tercih edilebilirken, bu yöntem uzamsal ve zamansal hassasiyetlerden yoksundir. Burada fUS görüntüleme tarayıcısıyla tetiklenen gibi otomatik bir uyarıcının kullanılması, başlangıç zamanı, genlik yer değiştirmesi, frekans ve Q ucu / tarak açısı dahil olmak üzere çeşitli parametrelerin daha iyi kontrol edilmesine izin verir ve bu da hayvanlar arası daha iyi bir tekrarlanabilirlik sağlar. Ek olarak, daha hassas bir stimülasyon zamanlaması,12,13parametrelerinin başlangıç ve pik yapma süresini belirleyerek Hemodinamik Yanıt İşlevinin (HRF) modellenmesine olanak tanır. Stimülasyon sırasında saptırılan bıyıkların sayısı (ve dolayısıyla aktif bölgenin alanı) üzerinde daha iyi hassasiyet sağlamak için, daha sofistike uyarıcılar bu protokole uyarlanabilir. Işık8,ses14 veya koku sunumu15 gibi diğer birçok uyaran aynı protokol kullanılarak uygulanabilir.
Fonksiyonel ultrasonun uyanık ve uslu hayvanlarla uyumluluğu, diğer nörogörüntleme tekniklerine kıyasla önemli bir avantajdır ve anestezi önyargısı olmadan fonksiyonel aktivasyon haritalamasını sağlar. Havayla kaldırılan bir mobil ev kamerası kullanmak, doğrusal veya küresel koşu bantları gibi mevcut diğer kafa sabitleme cihazlarına iyi bir alternatiftir. Sıkıca kafa kafaya sabitlenirken, ev kamerasının hareketi fareye çevrede gezinme yanılsaması verir ve çok çeşitli davranış testlerinin fUS görüntüleme16ile birleştirilmiş olmasına izin verir. Bununla birlikte, kafa sabitleme alışkanlığı prosedürü, özellikle kafa karıştırıcı bir faktör olarak kabul edilebileceği deneyler için stresi azaltmak için önemli bir adım teşkil eder. Burada ayrıntılı olarak açıklanan prosedür (kafa fiksasyonuna 6 günlük kullanım ve alışkanlık) duyusal stimülasyon ve dinlenme durumu fonksiyonel bağlantısı için sağlam sonuçlar verir. Ancak, daha rafine davranış testleri için alışkanlık süresini uzatmak gerekebilir17.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) Advanced Grant N° 339244-FUSIMAGINE tarafından desteklenmiştir. Ulusal Araştırma Ajansı ‘Pinch’ (ANR-18-CE37-005), Biyomedikal Ultrasonda Inserm Araştırma Teknolojisi Hızlandırıcısı, IPNP’nin ElfUS teknik çekirdeği, Inserm U1266, İnsan Beyni Projesi’nin Avrupa araştırma programı FUSIMICE ve Andrea Kliewer’a EMBO Kısa Vadeli Burs 8439.
Materials
| BD Plastipak 1 mL syringes | Dutscher, France | 303172 | |
| BD Microlance 26 Gauge needles | Dutscher, France | 303800 | |
| Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe) | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Arduino | Arduino | Arduino Uno-Rev3 | |
| Atipamezole | Orion Pharma, France | Antisedan® | 5 mg/ml injectable solution |
| Dental Ciment | Sun Médical, Shiga, japan | Superbond C&B | |
| Depilatory cream | Klorane | N/A | |
| Eye Ointment | TVM, UK | Ocry-gel | |
| Hair trimmer | Wella Profesionnals | N/A | |
| Head plates | Neurotar, Finland | Model 14 | |
| Iconeus One standard package for fUS | Iconeus, France | Iconeus One | |
| IcoScan acquisition software (v1.0) | Iconeus, France | IcoScan | |
| IcoStudio analysis software (v1.0) | Iconeus, France | IcoStudio | |
| Isoflurane Anesthesia station | Minerve, Esternay, France | ||
| Ketamine | Virbac, France | Ketamine1000 | 100 mg/ml injectable solution |
| Lidocaine | Vetoquinol | Lurocaine® | 20 mg/ml injectable solution |
| Medetomidine | Orion Pharma, France | Domitor® | 1 mg/ml injectable solution |
| Meloxicam | Boehringer lingelheim | Metacam® | 0.5 mg/ml injectable solution |
| Mobile HomeCage Large with tracking capability | Neurotar, Finland | MHC-L-T-V4 | |
| Monitoring of ECG and breathing rate | AD Systems, (USA) and LabChart software | ||
| Servomotor | Feetech | FT90B | |
| Stereotaxic frame | David Kopf (Tujunga, USA) | 900-WA | Using Mouse Adaptor (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922) |
| Surgical glue | 3M, USA | Vetbond | |
| Syringe Pump | KD Scientific, USA | Legato® 130, Cat# 788130 | |
| Ultrasound gel | DREXCO medical, France | Medi'Gel | |
| Xylazine 2% | Bayer, France | Rompun® | 20 mg/ml injectable solution |
References
- Hoyer, C., Gass, N., Weber-Fahr, W., Sartorius, A. Advantages and challenges of small animal magnetic resonance imaging as a translational tool. Neuropsychobiology. 69 (4), 187-201 (2014).
- Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art. Current Opinion in Neurobiology. 50, 128-135 (2018).
- Rabut, C., et al. Pharmaco-fUS: Quantification of pharmacologically-induced dynamic changes in brain perfusion and connectivity by functional ultrasound imaging in awake mice. NeuroImage. 222, 117231 (2020).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Ferrier, J., Tiran, E., Deffieux, T., Tanter, M., Lenkei, Z. Functional imaging evidence for task-induced deactivation and disconnection of a major default mode network hub in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (26), 15270-15280 (2020).
- Rabut, C., et al. 4D functional ultrasound imaging of whole-brain activity in rodents. Nature Methods. 16 (10), 994-997 (2019).
- Brunner, C., et al. A platform for brain-wide volumetric functional ultrasound imaging and of circuit dynamics in awake mice. Neuron. 108 (5), 861-875 (2020).
- Gesnik, M., et al. 3D functional ultrasound imaging of the cerebral visual system in rodents. NeuroImage. 149, 267-274 (2017).
- Macé, &. #. 2. 0. 1. ;., et al. Whole-brain functional ultrasound imaging reveals brain modules for visuomotor integration. Neuron. 100 (5), 1241-1251 (2018).
- Macé, E., Montaldo, G., Cohen, I., Baulac, M., Fink, M., Tanter, M. Functional ultrasound imaging of the brain. Nature Methods. 8 (8), 662-664 (2011).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Claron, J., et al. Large scale functional ultrasound imaging of the spinal cord reveals in depth spatiotemporal responses of spinal nociceptive circuits in both normal and inflammatory state. Pain. , (2020).
- Aydin, A. K., et al. Transfer functions linking neural calcium to single voxel functional ultrasound signal. Nature Communications. 11 (1), 2954 (2020).
- Bimbard, C., et al. Multi-scale mapping along the auditory hierarchy using high-resolution functional ultrasound in the awake ferret. eLife. 7, 35028 (2018).
- Boido, D., et al. Mesoscopic and microscopic imaging of sensory responses in the same animal. Nature Communications. 10 (1), 1110 (2019).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: A new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments. (88), e51869 (2014).
- Juczewski, K., Koussa, J. A., Kesner, A. J., Lee, J. O., Lovinger, D. M. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice. Scientific Reports. 10 (1), 12245 (2020).
