Modelo de cocultivo sin contacto para el estudio de la activación de células inmunes innatas durante la infección por virus respiratorios
Summary
Este protocolo detalla una investigación de las interacciones tempranas entre las células epiteliales nasales infectadas viralmente y la activación de células innatas. Los subconjuntos individuales de células inmunes se pueden distinguir en función de su activación en respuesta a infecciones virales. Luego se pueden investigar más a fondo para determinar sus efectos sobre las respuestas antivirales tempranas.
Abstract
Las interacciones tempranas entre la capa epitelial nasal y las células inmunes innatas durante las infecciones virales siguen siendo un área poco explorada. La importancia de la señalización de la inmunidad innata en las infecciones virales ha aumentado sustancialmente a medida que los pacientes con infecciones respiratorias que exhiben una alta activación innata de las células T muestran un mejor resultado de la enfermedad. Por lo tanto, la disección de estas interacciones inmunes innatas tempranas permite la elucidación de los procesos que las gobiernan y puede facilitar el desarrollo de posibles dianas terapéuticas y estrategias para amortiguar o incluso prevenir la progresión temprana de las infecciones virales. Este protocolo detalla un modelo versátil que se puede utilizar para estudiar la diafonía temprana, las interacciones y la activación de las células inmunes innatas a partir de factores secretados por las células epiteliales de las vías respiratorias infectadas viralmente. Utilizando un virus de la influenza H3N2 (A/Aichi/2/1968) como modelo de virus representativo, la activación celular innata de células mononucleares de sangre periférica cocultivadas (PBMC) se ha analizado mediante citometría de flujo para investigar los subconjuntos de células que se activan por los factores solubles liberados del epitelio en respuesta a la infección viral. Los resultados demuestran la estrategia de gating para diferenciar los subconjuntos de células y revelan las claras diferencias entre las poblaciones activadas de PBMC y su diafonía con el epitelio control e infectado. Los subconjuntos activados se pueden analizar más a fondo para determinar sus funciones, así como los cambios moleculares específicos de las células. Los hallazgos de dicha investigación de diafonía pueden descubrir factores que son importantes para la activación de poblaciones vitales de células innatas, que son beneficiosos para controlar y suprimir la progresión de la infección viral. Además, estos factores se pueden aplicar universalmente a diferentes enfermedades virales, especialmente a los virus recién emergentes, para amortiguar el impacto de dichos virus cuando circulan por primera vez en poblaciones humanas ingenuas.
Introduction
Los virus respiratorios se encuentran quizás entre los patógenos más extendidos que causan una grave carga sanitaria y económica. Desde los brotes mundiales periódicos de cepas epidémicas emergentes (por ejemplo, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) hasta las cepas estacionales de influenza cada año, los virus son una amenaza constante para la salud pública. Aunque las vacunas constituyen la mayor parte de la respuesta a estos desafíos de salud pública mundial, es aleccionador observar que estas contramedidas son simplemente receptivas 1,2. Además, un retraso entre la aparición de una nueva cepa infecciosa y el desarrollo exitoso de su vacuna es inevitable3, lo que lleva a un período en el que las medidas disponibles para frenar la propagación del virus son muy limitadas.
Estos retrasos se enfatizan aún más por los costos que se infligen a la sociedad, económica y socialmente. Solo la gripe estacional es responsable de aproximadamente $ 8 mil millones en costos indirectos, $ 3.2 mil millones en costos médicos y 36.3 mil muertes en los Estados Unidos de América anualmente4. Esto es antes de considerar los costos de investigación que son necesarios para financiar el desarrollo de vacunas. Los brotes epidémicos tienen efectos aún más graves en la sociedad, agravados por la creciente tasa de globalización cada año, como lo demuestran las perturbaciones mundiales causadas por la aparición y rápida propagación del coronovirus del síndrome respiratorio agudo grave 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.
Estudios recientes han demostrado que los pacientes infectados que tienen una mayor población de células T innatas activadas tienden a tener un mejor resultado de la enfermedad 8,9,10. Además, la población de células T innatas se clasifica en múltiples subgrupos: las células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT), las células T Vδ1 γδ, las células T Vδ2 γδ y las células T asesinas naturales (NKT). Estos subgrupos de células T innatas también exhiben heterogeneidad dentro de sus poblaciones, aumentando la complejidad de las interacciones entre las poblaciones celulares involucradas en la respuesta inmune innata11. Por lo tanto, el mecanismo que activa estas células T innatas y el conocimiento de los subgrupos específicos de células T innatas pueden proporcionar una vía diferente de investigación para reducir los efectos infecciosos de estos virus en el huésped humano, especialmente durante el período de desarrollo de la vacuna.
Las células epiteliales infectadas por la influenza producen factores que activan rápidamente las células T innatas 12,13,14. Sobre la base de ese hallazgo, este modelo de cocultivo de interfaz aire-líquido (ALI) sin contacto tiene como objetivo imitar las interacciones químicas tempranas (mediadas por factores solubles liberados por la capa epitelial infectada) entre la capa epitelial nasal infectada y los PBMC durante la infección temprana. La separación física entre la capa epitelial nasal (cultivada en insertos de membrana) y los PBMC (en la cámara inferior) y la integridad epitelial previenen la infección directa de los PBMC por el virus, lo que permite un estudio detallado de los efectos de los factores solubles derivados del epitelio en los PBMC. Por lo tanto, los factores identificados pueden investigarse más a fondo por su potencial terapéutico para inducir la población de células T innatas adecuada que puede proteger contra la infección por influenza. Por lo tanto, este artículo ha detallado los métodos para establecer un cocultivo para el estudio de la activación innata de células T a partir de factores solubles derivados del epitelio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las respuestas inmunes innatas contra los virus son un campo de estudio poco investigado en el manejo de antivirales. Las células epiteliales de las vías respiratorias y las células inmunes innatas trabajan en conjunto para suprimir la replicación viral durante una infección, además de servir como determinante de la respuesta adaptativa hiperactiva si la carga viral no se mantiene bajo control 12,13,17. Sin embargo, el des…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer al personal de investigación en el Departamento de Otorrinolaringología de NUS y el Departamento de Microbiología e Inmunología por su ayuda con el trabajo relacionado con el cultivo y el cultivo viral de hNEC. También nos gustaría agradecer a los cirujanos y al equipo quirúrgico del Hospital universitario nacional, Departamento de Otorrinolaringología, por su ayuda en el suministro de las muestras de células y sangre necesarias para el estudio.
Este estudio fue financiado por el Consejo Nacional de Investigación Médica, Singapur No. NMRC/CIRG/1458/2016 (a De Yun Wang) y MOH-OFYIRG19may-0007 (a Kai Sen Tan). Kai Sen Tan ha recibido el apoyo de la beca de investigación European Allergy and Clinical Immunology (EAACI) 2019.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
| 1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
| 10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
| 10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
| 12-well Plate | Corning | 3513 | |
| 12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
| 1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
| 2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
| 24-well Plate | Corning | 3524 | |
| 24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
| 37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
| 5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
| Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
| Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Crystal Violet | Merck | C6158 | |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
| DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
| DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
| dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
| EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
| EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
| FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
| Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
| Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
| Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
| Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
| H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
| H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
| H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
| H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
| H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
| hNESPCs | Human Donors | NA | |
| Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
| Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
| Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
| MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II – Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
| M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
| N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
| NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
| Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
| Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
| RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
| RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
| STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
| Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
| V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 | |
References
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