호흡기 바이러스 감염 동안 선천적 면역 세포 활성화의 연구를 위한 비접촉식 공동 배양 모델
Summary
이 프로토콜은 바이러스적으로 감염된 비강 상피 세포와 선천적 세포 활성화 사이의 초기 상호 작용에 대한 조사를 자세히 설명합니다. 면역 세포의 개별 서브세트는 바이러스 감염에 대한 반응에서의 그들의 활성화에 기초하여 구별될 수 있다. 그런 다음 초기 항 바이러스 반응에 미치는 영향을 결정하기 위해 더 조사 할 수 있습니다.
Abstract
바이러스 감염 중 비강 상피층과 선천적 면역 세포 사이의 초기 상호 작용은 아직 탐구되지 않은 영역으로 남아 있습니다. 바이러스 감염에서 선천적 면역 신호전달의 중요성은 높은 선천적 T 세포 활성화를 나타내는 호흡기 감염 환자가 더 나은 질병 결과를 보임에 따라 실질적으로 증가하였다. 따라서, 이러한 초기 선천적 면역 상호작용을 해부하는 것은 이들을 지배하는 과정의 해명을 허용하고, 바이러스 감염의 초기 진행을 감쇠시키거나 심지어 예방하기 위한 잠재적인 치료 표적 및 전략의 개발을 촉진할 수 있다. 이 프로토콜은 바이러스적으로 감염된 기도 상피 세포에 의해 분비되는 인자로부터 초기 누화, 상호작용 및 선천적 면역 세포의 활성화를 연구하는데 사용될 수 있는 다목적 모델을 상세히 기술한다. 대표적인 바이러스 모델로 H3N2 인플루엔자 바이러스(A/Aichi/2/1968)를 사용하여 공동 배양된 말초혈액 단핵구(PBMCs)의 선천적 세포 활성화를 유세포 분석기를 사용하여 바이러스 감염에 반응하여 상피에서 방출되는 가용성 인자에 의해 활성화되는 세포의 하위 집합을 조사하기 위해 분석되었습니다. 이 결과는 세포의 서브셋을 분화시키기 위한 게이팅 전략을 입증하고, PBMCs의 활성화된 집단과 대조군 및 감염된 상피와의 그들의 누화 사이의 명확한 차이를 드러낸다. 그 다음, 활성화된 서브세트는 그들의 기능뿐만 아니라 세포에 특이적인 분자 변화를 결정하기 위해 추가로 분석될 수 있다. 이러한 누화 조사의 결과는 바이러스 감염의 진행을 통제하고 억제하는 데 도움이되는 중요한 선천적 세포 집단의 활성화에 중요한 요인을 발견 할 수 있습니다. 또한, 이러한 요인은 다른 바이러스 질환, 특히 새로 출현하는 바이러스에 보편적으로 적용되어 순진한 인간 집단에서 처음 순환 할 때 그러한 바이러스의 영향을 약화시킬 수 있습니다.
Introduction
호흡기 바이러스는 아마도 심각한 건강 관리 및 경제적 부담을 초래하는 가장 널리 퍼진 병원체 중 하나 일 것입니다. 신흥 유행성 균주 (예 : H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19)의 정기적 인 세계적 발병에서부터 매년 인플루엔자의 계절적 변종에 이르기까지 바이러스는 공중 보건에 지속적인 위협이됩니다. 백신이 이러한 세계 공중 보건 문제에 대한 대응의 주요 대부분을 형성하지만, 이러한 대응 조치는 단지 1,2에 불과하다는 점에 유의하는 것은 냉정합니다. 또한, 새로운 감염성 균주의 출현과 백신의 성공적인 개발 사이의 지연은 불가피하며3, 바이러스의 확산을 억제하기 위한 가능한 조치가 매우 제한적인 시기로 이어진다.
이러한 지연은 경제적, 사회적으로 사회에 가해지는 비용에 의해 더욱 강조됩니다. 계절성 독감 만 간접 비용으로 약 80 억 달러, 의료 비용 3.2 억 달러, 미국에서 매년 36.3 천 명의 사망자를 초래합니다4. 이것은 백신 개발 자금을 조달하는 데 필요한 연구 비용을 고려하기 전입니다. 전염병 발생은 심각한 급성 호흡기 증후군 코로 노 바이러스 2 (SARS-CoV-2)5,6,7의 출현과 급속한 확산으로 인한 세계적인 혼란으로 입증 된 바와 같이 매년 세계화의 증가율에 의해 복합적으로 사회에 더욱 심각한 영향을 미칩니다.
최근 연구에 따르면 활성화 된 선천적 T 세포 집단이 더 많은 감염된 환자는 더 나은 질병 결과 8,9,10을 갖는 경향이 있습니다. 더욱이, 선천적 T 세포 집단은 다수의 하위군으로 분류된다: 점막-관련 불변 T (MAIT) 세포, Vδ1 γδ T 세포, Vδ2 γδ T 세포, 및 자연 살해 T (NKT) 세포. 선천적 T 세포의 이들 하위군은 또한 그들의 집단 내에서 이질성을 나타내어, 선천적 면역 반응에 관여하는 세포 집단 사이의 상호작용의 복잡성을 증가시킨다(11). 따라서, 이러한 선천적 T 세포를 활성화시키는 메카니즘 및 선천적 T 세포의 특정 하위군에 대한 지식은 특히 백신 개발 기간 동안 인간 숙주에 대한 이들 바이러스의 감염성 효과를 감소시키기 위한 연구의 다른 길을 제공할 수 있다.
인플루엔자에 의해 감염된 상피 세포는 선천적 T 세포를 빠르게 활성화시키는 인자를 생산한다12,13,14. 이러한 발견을 바탕으로 이 비접촉식 공기-액체 인터페이스(ALI) 공동 배양 모델은 초기 감염 동안 감염된 비강 상피층과 PBMC 사이의 초기 화학적 상호작용(감염된 상피층에 의해 방출되는 가용성 인자에 의해 매개됨)을 모방하는 것을 목표로 합니다. 비강 상피층(막 삽입물에서 배양됨)과 PBMCs(아래 챔버 내) 사이의 물리적 분리와 상피 완전성은 바이러스에 의한 PBMC의 직접적인 감염을 방지하여, 상피 유래 가용성 인자가 PBMC에 미치는 영향에 대한 상세한 연구를 가능하게 한다. 따라서 확인된 인자는 인플루엔자 감염으로부터 보호할 수 있는 적절한 선천적 T 세포 집단을 유도하는데 있어서 그들의 치료 잠재력에 대해 추가로 조사될 수 있다. 따라서이 논문은 상피 유래 가용성 인자로부터의 선천적 T 세포 활성화의 연구를 위한 공동 배양을 확립하는 방법을 상세히 기술하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
바이러스에 대한 선천적 면역 반응은 항 바이러스 관리에 대한 조사가 부족한 연구 분야입니다. 기도 상피 세포와 선천적 면역 세포는 바이러스 부하가 유지되지 않을 경우 과민성 적응 반응의 결정 요인으로 작용하는 것 외에도 감염 중에 바이러스 복제를 억제하기 위해 함께 작용합니다12,13,17. 그러나, 적절한 항바이러스 반…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 hNEC 문화 및 바이러스 문화 관련 작업에 도움을 주신 NUS 이비인후과 및 미생물학 및 면역학과의 연구 직원에게 감사드립니다. 우리는 또한 연구에 필요한 세포 및 혈액 샘플을 제공하는 데 도움을 주신 국립 대학 병원, 이비인후과 국립대학 병원의 외과 의사 및 외과 팀에 감사드립니다.
이 연구는 National Medical Research Council, Singapore No.의 지원을 받았습니다. NMRC / CIRG / 1458 / 2016 (De Yun Wang까지) 및 MOH-OFYIRG19may-0007 (Kai Sen Tan까지). Kai Sen Tan은 유럽 알레르기 및 임상 면역학 (EAACI) Research Fellowship 2019의 펠로우십 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
| 1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
| 10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
| 10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
| 12-well Plate | Corning | 3513 | |
| 12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
| 1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
| 2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
| 24-well Plate | Corning | 3524 | |
| 24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
| 37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
| 5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
| Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
| Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Crystal Violet | Merck | C6158 | |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
| DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
| DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
| dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
| EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
| EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
| FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
| Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
| Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
| Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
| Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
| H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
| H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
| H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
| H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
| H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
| hNESPCs | Human Donors | NA | |
| Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
| Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
| Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
| MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II – Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
| M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
| N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
| NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
| Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
| Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
| RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
| RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
| STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
| Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
| V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 | |
References
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