Summary

Modello di co-coltura senza contatto per lo studio dell'attivazione delle cellule immunitarie innate durante l'infezione da virus respiratorio

Published: February 28, 2021
doi:

Summary

Questo protocollo descrive in dettaglio un’indagine sulle prime interazioni tra cellule epiteliali nasali infettate viralmente e attivazione cellulare innata. I singoli sottoinsiemi di cellule immunitarie possono essere distinti in base alla loro attivazione in risposta alle infezioni virali. Possono quindi essere ulteriormente studiati per determinare i loro effetti sulle prime risposte antivirali.

Abstract

Le prime interazioni tra lo strato epiteliale nasale e le cellule immunitarie innate durante le infezioni virali rimangono un’area poco esplorata. Il significato della segnalazione dell’immunità innata nelle infezioni virali è aumentato sostanzialmente poiché i pazienti con infezioni respiratorie che mostrano un’elevata attivazione innata delle cellule T mostrano un esito migliore della malattia. Quindi, sezionare queste prime interazioni immunitarie innate consente di chiarire i processi che le governano e può facilitare lo sviluppo di potenziali bersagli terapeutici e strategie per smorzare o addirittura prevenire la progressione precoce delle infezioni virali. Questo protocollo descrive un modello versatile che può essere utilizzato per studiare la diafonia precoce, le interazioni e l’attivazione delle cellule immunitarie innate da fattori secreti da cellule epiteliali delle vie aeree infettate viralmente. Utilizzando un virus influenzale H3N2 (A/Aichi/2/1968) come modello di virus rappresentativo, l’attivazione cellulare innata delle cellule mononucleate del sangue periferico co-coltivate (PBMC) è stata analizzata utilizzando la citometria a flusso per studiare i sottoinsiemi di cellule che vengono attivate dai fattori solubili rilasciati dall’epitelio in risposta all’infezione virale. I risultati dimostrano la strategia di gating per differenziare i sottoinsiemi di cellule e rivelano le chiare differenze tra le popolazioni attivate di PBMC e il loro crosstalk con il controllo e l’epitelio infetto. I sottoinsiemi attivati possono quindi essere ulteriormente analizzati per determinare le loro funzioni e i cambiamenti molecolari specifici delle cellule. I risultati di tale indagine crosstalk possono scoprire fattori importanti per l’attivazione di popolazioni cellulari innate vitali, che sono utili nel controllare e sopprimere la progressione dell’infezione virale. Inoltre, questi fattori possono essere universalmente applicati a diverse malattie virali, in particolare ai virus emergenti di recente, per smorzare l’impatto di tali virus quando circolano per la prima volta in popolazioni umane ingenue.

Introduction

I virus respiratori sono forse tra i patogeni più diffusi che causano gravi oneri sanitari ed economici. Dai periodici focolai globali di ceppi epidemici emergenti (ad esempio, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) ai ceppi stagionali di influenza ogni anno, i virus sono una minaccia costante per la salute pubblica. Sebbene i vaccini costituiscano la maggior parte della risposta a queste sfide globali per la salute pubblica, fa riflettere notare che queste contromisure sono semplicemente reattive 1,2. Inoltre, un ritardo tra l’emergere di un nuovo ceppo infettivo e il successo dello sviluppo del suo vaccino è inevitabile3, portando a un periodo in cui le misure disponibili per frenare la diffusione del virus sono altamente limitate.

Questi ritardi sono ulteriormente enfatizzati dai costi che vengono inflitti alla società, economicamente e socialmente. L’influenza stagionale da sola è responsabile di circa 8 miliardi di dollari di costi indiretti, 3,2 miliardi di dollari di spese mediche e 36,3 mila morti negli Stati Uniti d’America ogni anno4. Questo prima di considerare i costi di ricerca necessari per finanziare lo sviluppo del vaccino. Le epidemie hanno effetti ancora più gravi sulla società, aggravati dal crescente tasso di globalizzazione ogni anno, come evidenziato dalle interruzioni globali causate dall’emergere e dalla rapida diffusione del coronovirus della sindrome respiratoria acuta grave 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.

Studi recenti hanno dimostrato che i pazienti infetti che hanno una maggiore popolazione di cellule T innate attivate tendono ad avere un esito migliore della malattia 8,9,10. Inoltre, la popolazione innata di cellule T è classificata in più sottogruppi: le cellule T invarianti associate alla mucosa (MAIT), le cellule T Vδ1 γδ, le cellule T Vδ2 γδ e le cellule T natural killer (NKT). Questi sottogruppi di cellule T innate mostrano anche eterogeneità all’interno delle loro popolazioni, aumentando la complessità delle interazioni tra le popolazioni cellulari coinvolte nella risposta immunitaria innata11. Quindi, il meccanismo che attiva queste cellule T innate e la conoscenza dei sottogruppi specifici di cellule T innate possono fornire una diversa via di ricerca per ridurre gli effetti infettivi di questi virus sull’ospite umano, specialmente durante il periodo di sviluppo del vaccino.

Le cellule epiteliali infettate dall’influenza producono fattori che attivano rapidamente le cellule T innate 12,13,14. Basandosi su questa scoperta, questo modello di co-coltura Air-Liquid Interface (ALI) senza contatto mira a imitare le prime interazioni chimiche (mediate da fattori solubili rilasciati dallo strato epiteliale infetto) tra lo strato epiteliale nasale infetto e le PBMC durante l’infezione precoce. La separazione fisica tra lo strato epiteliale nasale (coltivato su inserti di membrana) e le PBMC (nella camera sottostante) e l’integrità epiteliale prevengono l’infezione diretta delle PBMC da parte del virus, consentendo uno studio dettagliato degli effetti dei fattori solubili derivati dall’epitelio sulle PBMC. I fattori identificati possono quindi essere ulteriormente studiati per il loro potenziale terapeutico nell’indurre l’appropriata popolazione di cellule T innate che possono proteggere dall’infezione influenzale. Questo documento ha quindi dettagliato i metodi per stabilire una co-coltura per lo studio dell’attivazione innata delle cellule T da fattori solubili derivati dall’epitelio.

Protocol

NOTA: fare riferimento alla Tabella 1 per le ricette dei supporti utilizzati in questo protocollo.NOTA: hNECS coltivati su transwell a 12 pozzetti sono stati trovati per crescere in uno spessore più ottimale per i fattori solubili per raggiungere facilmente la camera basale quando infettati dal virus dell’influenza. Quindi si raccomanda l’uso di transwell di dimensioni 12-well per la co-coltura. 1. Istituzione dello strato di alimentazione 3T3 Stabilimento a par…

Representative Results

Sebbene le cellule T convenzionali costituiscano il principale repertorio di risposta immunitaria adattativa contro l’infezione virale per facilitare la clearance virale, la popolazione innata di cellule T lavora su uno spettro più ampio per sopprimere la carica virale per una clearance efficace in una fase successiva. Pertanto, questo protocollo crea specificamente una condizione robusta per studiare le cellule T innate, la loro attivazione e la loro popolazione funzionale a seguito del…

Discussion

Le risposte immunitarie innate contro i virus sono un campo di studio poco studiato nella gestione antivirale. Le cellule epiteliali delle vie aeree e le cellule immunitarie innate lavorano di concerto per sopprimere la replicazione virale durante un’infezione, oltre a servire come determinante della risposta adattativa iperattiva se la carica virale non viene tenuta sotto controllo 12,13,17. Tuttavia, lo sviluppo di un modello …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare il personale di ricerca del Dipartimento di Otorinolaringoiatria della NUS e del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia per il loro aiuto con il lavoro relativo alla cultura hNEC e alla cultura virale. Vorremmo anche ringraziare i chirurghi e il team chirurgico del National University Hospital, Dipartimento di Otorinolaringoiatria, per la loro assistenza nel fornire i campioni di cellule e sangue necessari per lo studio.
Questo studio è stato finanziato dal National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (a De Yun Wang) e MOH-OFYIRG19may-0007 (a Kai Sen Tan). Kai Sen Tan ha ricevuto una borsa di studio sostenuta dalla European Allergy and Clinical Immunology (EAACI) Research Fellowship 2019.

Materials

0.5% Trypsin-EDTA Gibco 15400-054
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free Thermofisher AM9260G 0.5M EDTA
1.5 mL SafeLock Tubes Eppendorf 0030120086 1.5mL Centrifuge Tube
10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes BD 366643 10mL Blood Collection Tubes
10x dPBS Gibco 14200-075
10x PBS Vivantis PC0711
12-well Plate Corning  3513
12-well Transwell Insert Corning  3460 membrane insert
1x FACS Lysing Solution BD 349202
2.0 mL SafeLock Tubes Eppendorf 0030120094 2 mL centrifuge tube
24-well Plate Corning  3524
24-well Transwell Insert Corning  3470
3% Acetic Acid with Methylene Blue STEMCELL Technologies 07060
3,3',5-triiodo-l-thyronine Sigma T-074
37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O Sigma 533998
5810R Centrifuge Eppendorf 5811000320
5 mL polypropylene tubes (flow tubes) BD 352058
70 µm Cell Strainer Corning  431751
A-4-62 Rotor Eppendorf 5810709008
Accutase Gibco A1110501 Cell Dissociation Reagent
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062
Avicel CL-611 FMC Biopolymer NA Liquid Overlay
Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software Bio-Rad Laboratories, Inc 171STND01 Multiplex Manager Software
Butterfly Needle 21 G BD 367287
Cholera Toxin Sigma C8052
Crystal Violet  Merck C6158
Cytofix/Cytoperm Solution BD 554722 Fixation and Permeabilization Solution
Dispase II Sigma D4693 Neutral Protease
DMEM/High Glucose GE Healthcare Life Sciences SH30243.01
DMEM/Nutrient Mixture F-12 Gibco-Invitrogen 11320033
dNTP Mix Promega U1515 dNTP Mix
EMEM (w L-Glutamine) ATCC 30-2003
EVOM voltohmmeter device WPI, Sarasota, FL, USA 300523
FACS Lysing Solution BD 349202 1x Lysing Solution
Falcon tube 15 mL CellStar 188271 15 mL tube
Falcon tube 50 mL CellStar 227261 50 mL Tube
Fast Start Essential DNA Probes Master Roche 6402682001 qPCR Master Mix
Ficoll Paque Premium Research Instruments 17544203 Density Gradient Media
H3N2 (A/Aichi/2/1968)  ATCC VR547
H3N2 M1 Forward Primer Sequence Sigma 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'
H3N2 M1 Reverse Primer Sequence Sigma 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'
H3N2 NS1 Forward Primer Sequence Sigma 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'
H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence Sigma 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Gibco 10500-064
hNESPCs Human Donors NA
Human Epithelial Growth Factor Gibco-Invitrogen PHG0314
Hydrocortisone STEMCELL Techonologies 7925 Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries
Insulin Sigma I3536
Lightcycler 96 Roche 5815916001 qPCR Instrument
Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation Thermofisher L23105 Viability Stain
MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II – Premixed 23 Plex Merck Pte Ltd HCP2MAG-62K-PX23 Immunology Multiplex Assay
Mitomycin C Sigma M4287
M-MLV 5x Buffer Promega M1705 RT-PCR 5x Buffer
M-MLV Reverse Transcriptase Promega M1706 Reverse Transcriptase
N-2 supplement Gibco-Invitrogen 17502-048
NIH/3T3 ATCC CRL1658
Perm/Wash Buffer BD 554723 Permeabilization Wash Buffer
PneumaCult-ALI 10x Supplement STEMCELL Techonologies 5001
PneumaCult-ALI Basal Medium STEMCELL Techonologies 5001
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) STEMCELL Techonologies 5001
Random Primers Promega C1181 Random Primers
Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor Promega N2511 RNase Inhibitor
RNA Lysis Buffer Qiagen Part of 52904
RPMI 1640 (w L-Glutamine) ATCC 30-2001
STX2 electrodes WPI, Sarasota, FL, USA STX2 Electrode
T25 Flask Corning 430639
T75 Flask Corning 430641U
TPCK Trypsin Sigma T1426
Trypan Blue Hyclone SV30084.01
Viral RNA Extraction Kit Qiagen 52904 Viral RNA Extraction Kit
V-Shaped 96-well Plate Corning 3894

References

  1. Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
  2. Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. Preparing for the next pandemic. The British Medical Journal. 346, 364 (2013).
  3. Gerdil, C. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).
  4. Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. Economic burden of seasonal influenza in the United States. Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).
  5. Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. COVID-19 and globalization. One Health. 9, 100132 (2020).
  6. Guo, Y. R., et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak – an update on the status. Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).
  7. Guan, W. J., et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).
  8. van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells are activated during human viral infections. Nature Communications. 7, 11653 (2016).
  9. Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. Gammadelta T cells: first line of defense and beyond. Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).
  10. van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo. Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).
  11. Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).
  12. Yan, Y., et al. Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).
  13. Luukkainen, A., et al. A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium. Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).
  14. Tan, K. S., et al. RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications. Cells. 8 (9), 986 (2019).
  15. Kim, N., et al. Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells. Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).
  16. Tan, K., et al. In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses. Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).
  17. Tan, K. S., et al. Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures. Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).
  18. Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation Available from: https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay (2020)
  19. Gamage, A. M., et al. Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).
  20. Zhao, X. N., et al. The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro. American Journal of Rhinology & Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).

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Cite This Article
Lew, Z. Z. R., Liu, J., Ong, H. H., Tan, V. J., Luukkainen, A., Ong, Y. K., Thong, M., Puan, K. J., Chow, V. T. K., Tan, K. S., Wang, D. Y. Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection. J. Vis. Exp. (168), e62115, doi:10.3791/62115 (2021).

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