Modèle de co-culture sans contact pour l’étude de l’activation des cellules immunitaires innées au cours d’une infection virale respiratoire
Summary
Ce protocole détaille une étude des interactions précoces entre les cellules épithéliales nasales infectées par le virus et l’activation des cellules innées. Des sous-ensembles individuels de cellules immunitaires peuvent être distingués en fonction de leur activation en réponse à des infections virales. Ils peuvent ensuite être étudiés plus avant pour déterminer leurs effets sur les réponses antivirales précoces.
Abstract
Les premières interactions entre la couche épithéliale nasale et les cellules immunitaires innées lors d’infections virales restent un domaine sous-exploré. L’importance de la signalisation de l’immunité innée dans les infections virales a considérablement augmenté à mesure que les patients atteints d’infections respiratoires présentant une activation élevée des lymphocytes T innés montrent un meilleur résultat de la maladie. Par conséquent, la dissection de ces interactions immunitaires innées précoces permet d’élucider les processus qui les régissent et peut faciliter le développement de cibles thérapeutiques potentielles et de stratégies pour amortir ou même prévenir la progression précoce des infections virales. Ce protocole détaille un modèle polyvalent qui peut être utilisé pour étudier la diaphonie précoce, les interactions et l’activation des cellules immunitaires innées à partir de facteurs sécrétés par les cellules épithéliales des voies respiratoires infectées par le virus. En utilisant un virus de la grippe H3N2 (A/Aichi/2/1968) comme modèle de virus représentatif, l’activation cellulaire innée des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) co-cultivées a été analysée à l’aide de la cytométrie en flux pour étudier les sous-ensembles de cellules qui sont activées par les facteurs solubles libérés par l’épithélium en réponse à l’infection virale. Les résultats démontrent la stratégie de contrôle pour différencier les sous-ensembles de cellules et révèlent les différences claires entre les populations activées de PBMC et leur diaphonie avec l’épithélium témoin et infecté. Les sous-ensembles activés peuvent ensuite être analysés plus avant pour déterminer leurs fonctions ainsi que les changements moléculaires spécifiques aux cellules. Les résultats d’une telle enquête de diaphonie peuvent révéler des facteurs importants pour l’activation des populations de cellules innées vitales, qui sont bénéfiques pour contrôler et supprimer la progression de l’infection virale. En outre, ces facteurs peuvent être universellement appliqués à différentes maladies virales, en particulier aux virus nouvellement émergents, afin d’atténuer l’impact de ces virus lorsqu’ils circulent pour la première fois dans des populations humaines naïves.
Introduction
Les virus respiratoires sont peut-être parmi les agents pathogènes les plus répandus, causant un lourd fardeau sanitaire et économique. Qu’il s’agisse des éclosions mondiales périodiques de souches épidémiques émergentes (p. ex., H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) ou des souches saisonnières de la grippe chaque année, les virus constituent une menace constante pour la santé publique. Bien que les vaccins constituent la majeure partie de la réponse à ces défis mondiaux de santé publique, il est désolant de noter que ces contre-mesures ne sont que réactives 1,2. En outre, un délai entre l’émergence d’une nouvelle souche infectieuse et le développement réussi de son vaccin est inévitable3, conduisant à une période où les mesures disponibles pour freiner la propagation du virus sont très limitées.
Ces retards sont encore accentués par les coûts qui sont infligés à la société, économiquement et socialement. La grippe saisonnière à elle seule est responsable d’environ 8 milliards de dollars en coûts indirects, de 3,2 milliards de dollars en coûts médicaux et de 36,3 mille décès aux États-Unis d’Amérique chaque année4. Ceci avant d’examiner les coûts de recherche nécessaires pour financer le développement d’un vaccin. Les flambées épidémiques ont des effets encore plus graves sur la société, aggravés par le taux croissant de mondialisation chaque année, comme en témoignent les perturbations mondiales causées par l’émergence et la propagation rapide du coronovirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2)5,6,7.
Des études récentes ont montré que les patients infectés ayant une plus grande population de lymphocytes T innés activés ont tendance à avoir un meilleur résultat de la maladie 8,9,10. En outre, la population de lymphocytes T innés est classée en plusieurs sous-groupes: les cellules T invariantes associées aux muqueuses (MAIT), les cellules T Vδ1 γδ, les cellules T Vδ2 γδ et les cellules T tueuses naturelles (NKT). Ces sous-groupes de lymphocytes T innés présentent également une hétérogénéité au sein de leurs populations, ce qui augmente la complexité des interactions entre les populations cellulaires impliquées dans la réponse immunitaire innée11. Par conséquent, le mécanisme qui active ces lymphocytes T innés et la connaissance des sous-groupes spécifiques de lymphocytes T innés peuvent fournir une autre voie de recherche pour réduire les effets infectieux de ces virus sur l’hôte humain, en particulier pendant la période de développement du vaccin.
Les cellules épithéliales infectées par la grippe produisent des facteurs qui activent rapidement les lymphocytes T innés 12,13,14. S’appuyant sur cette découverte, ce modèle de co-culture air-liquide (ALI) sans contact vise à imiter les interactions chimiques précoces (médiées par des facteurs solubles libérés par la couche épithéliale infectée) entre la couche épithéliale nasale infectée et les PBMC au cours de l’infection précoce. La séparation physique entre la couche épithéliale nasale (cultivée sur des inserts membranaires) et les PBMC (dans la chambre en dessous) et l’intégrité épithéliale empêchent l’infection directe des PBMC par le virus, permettant une étude détaillée des effets des facteurs solubles dérivés de l’épithélium sur les PBMC. Les facteurs identifiés peuvent donc être étudiés plus avant pour leur potentiel thérapeutique dans l’induction de la population de lymphocytes T innée appropriée qui peut protéger contre l’infection grippale. Cet article a donc détaillé les méthodes d’établissement d’une co-culture pour l’étude de l’activation des lymphocytes T innés à partir de facteurs solubles dérivés de l’épithélium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les réponses immunitaires innées contre les virus sont un domaine d’étude sous-étudié dans la gestion antivirale. Les cellules épithéliales des voies respiratoires et les cellules immunitaires innées agissent de concert pour supprimer la réplication virale pendant une infection, en plus de servir de déterminant de la réponse adaptative hyperactive si la charge virale n’est pas maîtrisée 12,13,17. Cependant, le d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le personnel de recherche du Département d’oto-rhino-laryngologie et du Département de microbiologie et d’immunologie du NUS pour leur aide dans le cadre des travaux liés à la culture hNEC et à la culture virale. Nous tenons également à remercier les chirurgiens et l’équipe chirurgicale du Département d’oto-rhino-laryngologie de l’Hôpital universitaire national pour leur aide à fournir les échantillons de cellules et de sang nécessaires à l’étude.
Cette étude a été financée par le National Medical Research Council, Singapour No. NMRC/CIRG/1458/2016 (à De Yun Wang) et MOH-OFYIRG19may-0007 (à Kai Sen Tan). Kai Sen Tan est récipiendaire d’une bourse de recherche 2019 de l’European Allergy and Clinical Immunology (EAACI).
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
| 1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
| 10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
| 10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
| 12-well Plate | Corning | 3513 | |
| 12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
| 1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
| 2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
| 24-well Plate | Corning | 3524 | |
| 24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
| 37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
| 5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
| Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
| Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Crystal Violet | Merck | C6158 | |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
| DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
| DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
| dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
| EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
| EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
| FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
| Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
| Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
| Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
| Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
| H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
| H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
| H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
| H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
| H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
| hNESPCs | Human Donors | NA | |
| Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
| Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
| Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
| MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II – Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
| M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
| N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
| NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
| Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
| Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
| RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
| RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
| STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
| Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
| V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 | |
References
- Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
- Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. Preparing for the next pandemic. The British Medical Journal. 346, 364 (2013).
- Gerdil, C. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).
- Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. Economic burden of seasonal influenza in the United States. Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).
- Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. COVID-19 and globalization. One Health. 9, 100132 (2020).
- Guo, Y. R., et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak – an update on the status. Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).
- Guan, W. J., et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells are activated during human viral infections. Nature Communications. 7, 11653 (2016).
- Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. Gammadelta T cells: first line of defense and beyond. Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo. Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).
- Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).
- Yan, Y., et al. Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).
- Luukkainen, A., et al. A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium. Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).
- Tan, K. S., et al. RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications. Cells. 8 (9), 986 (2019).
- Kim, N., et al. Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells. Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).
- Tan, K., et al. In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses. Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).
- Tan, K. S., et al. Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures. Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).
- Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation Available from: https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay (2020)
- Gamage, A. M., et al. Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).
- Zhao, X. N., et al. The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro. American Journal of Rhinology & Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).
