Summary

Kontaktfreies Co-Kultur-Modell zur Untersuchung der angeborenen Immunzellaktivierung während einer Infektion mit respiratorischen Viren

Published: February 28, 2021
doi:

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Untersuchung der frühen Wechselwirkungen zwischen viral infizierten Nasenepithelzellen und der angeborenen Zellaktivierung. Einzelne Untergruppen von Immunzellen können anhand ihrer Aktivierung als Reaktion auf Virusinfektionen unterschieden werden. Sie können dann weiter untersucht werden, um ihre Auswirkungen auf frühe antivirale Reaktionen zu bestimmen.

Abstract

Die frühen Wechselwirkungen zwischen der Nasenepithelschicht und den angeborenen Immunzellen während viraler Infektionen bleiben ein wenig erforschtes Gebiet. Die Bedeutung der angeborenen Immunitätssignalisierung bei Virusinfektionen hat erheblich zugenommen, da Patienten mit Atemwegsinfektionen, die eine hohe angeborene T-Zell-Aktivierung aufweisen, ein besseres Krankheitsergebnis zeigen. Daher ermöglicht die Sezierung dieser frühen angeborenen Immuninteraktionen die Aufklärung der Prozesse, die sie steuern, und kann die Entwicklung potenzieller therapeutischer Ziele und Strategien zur Dämpfung oder sogar Verhinderung des frühen Fortschreitens von Virusinfektionen erleichtern. Dieses Protokoll beschreibt ein vielseitiges Modell, mit dem frühe Übersprechen, Interaktionen und die Aktivierung angeborener Immunzellen aus Faktoren, die von viral infizierten Atemwegsepithelzellen abgesondert werden, untersucht werden können. Unter Verwendung eines H3N2-Influenzavirus (A/Aichi/2/1968) als repräsentatives Virusmodell wurde die angeborene Zellaktivierung von kokultivierten mononukleären Zellen im peripheren Blut (PBMCs) mittels Durchflusszytometrie analysiert, um die Untergruppen von Zellen zu untersuchen, die durch die löslichen Faktoren aktiviert werden, die als Reaktion auf die Virusinfektion aus dem Epithel freigesetzt werden. Die Ergebnisse demonstrieren die Gating-Strategie zur Differenzierung der Teilmengen von Zellen und zeigen die deutlichen Unterschiede zwischen den aktivierten Populationen von PBMCs und ihrem Crosstalk mit dem Kontroll- und infizierten Epithel. Die aktivierten Teilmengen können dann weiter analysiert werden, um ihre Funktionen sowie die für die Zellen spezifischen molekularen Veränderungen zu bestimmen. Die Ergebnisse einer solchen Crosstalk-Untersuchung können Faktoren aufdecken, die für die Aktivierung lebenswichtiger angeborener Zellpopulationen wichtig sind und für die Kontrolle und Unterdrückung des Fortschreitens der Virusinfektion von Vorteil sind. Darüber hinaus können diese Faktoren universell auf verschiedene Viruserkrankungen angewendet werden, insbesondere auf neu auftretende Viren, um die Auswirkungen solcher Viren zu dämpfen, wenn sie zum ersten Mal in naiven menschlichen Populationen zirkulieren.

Introduction

Atemwegsviren gehören vielleicht zu den am weitesten verbreiteten Krankheitserregern, die eine schwere Belastung für die Gesundheitsversorgung und die Wirtschaft verursachen. Von den periodischen globalen Ausbrüchen neu auftretender epidemischer Stämme (z. B. H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) bis hin zu den saisonalen Influenzastämmen jedes Jahr sind Viren eine ständige Bedrohung für die öffentliche Gesundheit. Obwohl Impfstoffe den Hauptteil der Reaktion auf diese globalen Herausforderungen im Bereich der öffentlichen Gesundheit ausmachen, ist es ernüchternd festzustellen, dass diese Gegenmaßnahmen lediglich reaktionsschnellsind 1,2. Darüber hinaus ist eine Verzögerung zwischen dem Auftreten eines neuen infektiösen Stammes und der erfolgreichen Entwicklung seines Impfstoffsunvermeidlich 3, was zu einer Zeit führt, in der die verfügbaren Maßnahmen zur Eindämmung der Ausbreitung des Virus stark begrenzt sind.

Diese Verzögerungen werden durch die Kosten, die der Gesellschaft – wirtschaftlich und sozial – entstehen, noch verstärkt. Allein die saisonale Grippe ist für etwa 8 Milliarden US-Dollar an indirekten Kosten, 3,2 Milliarden US-Dollar an medizinischen Kosten und 36,3.000 Todesfälle in den Vereinigten Staaten von Amerika jährlichverantwortlich 4. Dies geschieht vor der Berücksichtigung der Forschungskosten, die zur Finanzierung der Impfstoffentwicklung erforderlich sind. Epidemieausbrüche haben noch schwerwiegendere Auswirkungen auf die Gesellschaft, verstärkt durch die von Jahr zu Jahr zunehmende Globalisierungsrate, wie die globalen Störungen zeigen, die durch die Entstehung und schnelle Ausbreitung des schweren Coronovirus 2 (SARS-CoV-2) 5,6,7 verursacht werden.

Neuere Studien haben gezeigt, dass infizierte Patienten mit einer größeren Population von aktivierten angeborenen T-Zellen tendenziell ein besseres Krankheitsergebnis haben 8,9,10. Darüber hinaus wird die angeborene T-Zellpopulation in mehrere Untergruppen eingeteilt: die schleimhautassoziierten invarianten T-Zellen (MAIT), Vδ1 γδ T-Zellen, Vδ2 γδ T-Zellen und die natürlichen Killer-T-Zellen (NKT). Diese Untergruppen angeborener T-Zellen weisen auch eine Heterogenität innerhalb ihrer Populationen auf, was die Komplexität der Interaktionen zwischen den Zellpopulationen, die an der angeborenen Immunantwort beteiligt sind, erhöht 11. Daher kann der Mechanismus, der diese angeborenen T-Zellen aktiviert, und das Wissen über die spezifischen Untergruppen angeborener T-Zellen einen anderen Forschungsweg bieten, um die infektiösen Auswirkungen dieser Viren auf den menschlichen Wirt einzudämmen, insbesondere während der Zeit der Impfstoffentwicklung.

Epithelzellen, die mit Influenza infiziert sind, produzieren Faktoren, die angeborene T-Zellen schnell aktivieren12,13,14. Aufbauend auf diesem Befund zielt dieses kontaktlose Luft-Flüssig-Grenzflächenmodell (ALI) darauf ab, die frühen chemischen Wechselwirkungen (vermittelt durch lösliche Faktoren, die von der infizierten Epithelschicht freigesetzt werden) zwischen der infizierten Nasenepithelschicht und den PBMCs während einer frühen Infektion nachzuahmen. Die physikalische Trennung zwischen der Nasenepithelschicht (kultiviert auf Membraneinsätzen) und den PBMCs (in der darunter liegenden Kammer) und der epithelialen Integrität verhindert eine direkte Infektion der PBMCs durch das Virus und ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der Auswirkungen von epithelial abgeleiteten löslichen Faktoren auf die PBMCs. Die identifizierten Faktoren können daher hinsichtlich ihres therapeutischen Potenzials bei der Induktion der geeigneten angeborenen T-Zell-Population, die vor einer Influenza-Infektion schützen kann, weiter untersucht werden. Dieses Papier hat daher die Methoden zur Etablierung einer Kokultur für die Untersuchung der angeborenen T-Zell-Aktivierung aus Epithel-abgeleiteten löslichen Faktoren detailliert beschrieben.

Protocol

HINWEIS: In Tabelle 1 finden Sie die Rezepte der in diesem Protokoll verwendeten Medien.HINWEIS: Es wurde festgestellt, dass hNECS, die auf 12-Well Transwell gezüchtet werden, in eine optimalere Dicke für lösliche Faktoren wachsen, um die Basalkammer leicht zu erreichen, wenn sie mit dem Influenzavirus infiziert sind. Daher wird die Verwendung von 12-Well-Size-Transwell für die Kokultur empfohlen. 1. Aufbau der 3T3-Feederschicht Betrieb aus Tiefkühlbestände…

Representative Results

Obwohl konventionelle T-Zellen das Hauptrepertoire der adaptiven Immunantwort gegen Virusinfektionen bilden, um die virale Clearance zu erleichtern, arbeitet die angeborene T-Zell-Population über ein breiteres Spektrum, um die Viruslast für eine effektive Clearance in einem späteren Stadium zu unterdrücken. Daher schafft dieses Protokoll speziell eine robuste Bedingung, um angeborene T-Zellen, ihre Aktivierung und ihre funktionelle Population nach einer Influenza-Infektion zu untersuc…

Discussion

Angeborene Immunantworten gegen Viren sind ein wenig erforschtes Forschungsgebiet im antiviralen Management. Die Epithelzellen der Atemwege und die angeborenen Immunzellen arbeiten zusammen, um die Virusreplikation während einer Infektion zu unterdrücken, und dienen nicht nur als Determinante der überaktiven adaptiven Reaktion, wenn die Viruslast nicht in Schach gehaltenwird 12,13,17. Die Entwicklung eines relevanten Humanmod…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den wissenschaftlichen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der NUS Abteilung für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde und der Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie für ihre Hilfe bei der hNEC-Kultur- und Viruskultur-bezogenen Arbeit. Wir möchten auch den Chirurgen und dem chirurgischen Team des National University Hospital, Abteilung für HNO-Heilkunde, für ihre Unterstützung bei der Bereitstellung der für die Studie erforderlichen Zell- und Blutproben danken.
Diese Studie wurde vom National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (an De Yun Wang) und MOH-OFYIRG19may-0007 (an Kai Sen Tan). Kai Sen Tan erhält Stipendien im Rahmen des European Allergy and Clinical Immunology (EAACI) Research Fellowship 2019.

Materials

0.5% Trypsin-EDTA Gibco 15400-054
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free Thermofisher AM9260G 0.5M EDTA
1.5 mL SafeLock Tubes Eppendorf 0030120086 1.5mL Centrifuge Tube
10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes BD 366643 10mL Blood Collection Tubes
10x dPBS Gibco 14200-075
10x PBS Vivantis PC0711
12-well Plate Corning  3513
12-well Transwell Insert Corning  3460 membrane insert
1x FACS Lysing Solution BD 349202
2.0 mL SafeLock Tubes Eppendorf 0030120094 2 mL centrifuge tube
24-well Plate Corning  3524
24-well Transwell Insert Corning  3470
3% Acetic Acid with Methylene Blue STEMCELL Technologies 07060
3,3',5-triiodo-l-thyronine Sigma T-074
37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O Sigma 533998
5810R Centrifuge Eppendorf 5811000320
5 mL polypropylene tubes (flow tubes) BD 352058
70 µm Cell Strainer Corning  431751
A-4-62 Rotor Eppendorf 5810709008
Accutase Gibco A1110501 Cell Dissociation Reagent
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062
Avicel CL-611 FMC Biopolymer NA Liquid Overlay
Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software Bio-Rad Laboratories, Inc 171STND01 Multiplex Manager Software
Butterfly Needle 21 G BD 367287
Cholera Toxin Sigma C8052
Crystal Violet  Merck C6158
Cytofix/Cytoperm Solution BD 554722 Fixation and Permeabilization Solution
Dispase II Sigma D4693 Neutral Protease
DMEM/High Glucose GE Healthcare Life Sciences SH30243.01
DMEM/Nutrient Mixture F-12 Gibco-Invitrogen 11320033
dNTP Mix Promega U1515 dNTP Mix
EMEM (w L-Glutamine) ATCC 30-2003
EVOM voltohmmeter device WPI, Sarasota, FL, USA 300523
FACS Lysing Solution BD 349202 1x Lysing Solution
Falcon tube 15 mL CellStar 188271 15 mL tube
Falcon tube 50 mL CellStar 227261 50 mL Tube
Fast Start Essential DNA Probes Master Roche 6402682001 qPCR Master Mix
Ficoll Paque Premium Research Instruments 17544203 Density Gradient Media
H3N2 (A/Aichi/2/1968)  ATCC VR547
H3N2 M1 Forward Primer Sequence Sigma 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'
H3N2 M1 Reverse Primer Sequence Sigma 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'
H3N2 NS1 Forward Primer Sequence Sigma 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'
H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence Sigma 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Gibco 10500-064
hNESPCs Human Donors NA
Human Epithelial Growth Factor Gibco-Invitrogen PHG0314
Hydrocortisone STEMCELL Techonologies 7925 Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries
Insulin Sigma I3536
Lightcycler 96 Roche 5815916001 qPCR Instrument
Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation Thermofisher L23105 Viability Stain
MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II – Premixed 23 Plex Merck Pte Ltd HCP2MAG-62K-PX23 Immunology Multiplex Assay
Mitomycin C Sigma M4287
M-MLV 5x Buffer Promega M1705 RT-PCR 5x Buffer
M-MLV Reverse Transcriptase Promega M1706 Reverse Transcriptase
N-2 supplement Gibco-Invitrogen 17502-048
NIH/3T3 ATCC CRL1658
Perm/Wash Buffer BD 554723 Permeabilization Wash Buffer
PneumaCult-ALI 10x Supplement STEMCELL Techonologies 5001
PneumaCult-ALI Basal Medium STEMCELL Techonologies 5001
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) STEMCELL Techonologies 5001
Random Primers Promega C1181 Random Primers
Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor Promega N2511 RNase Inhibitor
RNA Lysis Buffer Qiagen Part of 52904
RPMI 1640 (w L-Glutamine) ATCC 30-2001
STX2 electrodes WPI, Sarasota, FL, USA STX2 Electrode
T25 Flask Corning 430639
T75 Flask Corning 430641U
TPCK Trypsin Sigma T1426
Trypan Blue Hyclone SV30084.01
Viral RNA Extraction Kit Qiagen 52904 Viral RNA Extraction Kit
V-Shaped 96-well Plate Corning 3894

References

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Lew, Z. Z. R., Liu, J., Ong, H. H., Tan, V. J., Luukkainen, A., Ong, Y. K., Thong, M., Puan, K. J., Chow, V. T. K., Tan, K. S., Wang, D. Y. Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection. J. Vis. Exp. (168), e62115, doi:10.3791/62115 (2021).

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