Akış Sitometri Analizi için Fare Böbrek-Resident CD8+ T hücrelerinin izolasyonu
Summary
Viral enfeksiyonutaki böbrek, nispeten çok sayıda CD8+ T hücrebarındırır ve mukozal olmayan TRM hücrelerini inceleme fırsatı sunar. Burada, akış sitometri analizi için fare böbrek lenfositleri izole etmek için bir protokol açıklar.
Abstract
Doku da yerleşik bellek T hücresi (TRM)immünoloji araştırmalarının hızla genişleyen bir alanıdır. Çeşitli lenfoid olmayan dokulardan T hücrelerinin izole TRMaraştırmak için önemli adımlardan biridir. Farklı organlar için lenfosit izolasyon protokollerinde hafif farklılıklar vardır. Böbrek patojen maruziyet veya otoimmün aktivasyon özellikle sonra çok sayıda bağışıklık hücresi infiltrasyonu ile önemli bir non-lenfoid organdır. Son yıllarda, bizim de dahil olmak üzere birden fazla laboratuvar fare ve insan çeşitli fizyolojik ve patolojik ortamlarda böbrek yerleşik CD8+ T hücreleri karakterize başlamıştır. T lenfositlerin bolluğu nedeniyle, böbrek non-mukozal veya non-bariyer dokularda TRMçalışmak için cazip bir model organ temsil eder. Burada, sistemik viral enfeksiyon sonrasında fare böbreklerinden CD8+ T hücrelerini izole etmek için TRModaklı laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılan bir protokolü açıklayacağız. Kısaca, C57BL/6 farelerinde akut lenfositik koryomeningit (LCMV) enfeksiyon modeli kullanarak, örnekleri sonraki akış sitometri analizine hazır hale getirmek için fare böbreklerinden lenfositleri izole etmek ve zenginleştirmek için intravasküler CD8+ T hücre etiketleme, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyan santrifüjünü gösteriyoruz.
Introduction
Doku da yerleşik bellek (TRM)T hücreleri yetişkin insan ve enfekte farelerde en bol T hücre popülasyonlarından birini temsil eder. TRM hücreleri bağışıklık savunmasının ilk hattını sağlar ve çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde kritik olarak yer alır1,2,3,4,5. Dolaşımdaki T hücreleri ile karşılaştırıldığında, TRM hücreleri benzersiz transkripsiyon programları6,7,8ile farklı yüzey belirteçleri taşır. TRM biyolojisi hakkındaki bilgimizi genişletmek, T hücre bazlı aşıların ve immünoterapilerin gelecekteki gelişimi için gerekli olan T hücre yanıtlarını anlamanın anahtarıdır.
Tüm lenfoid olmayan dokularda TRM’ninyaygın olarak paylaşılan moleküler belirteçlerine ek olarak, biriken kanıtlar dokuya özgü özelliklerin TRM biyolojisi 9’unmerkezi bir bileşeni olduğunu göstermektedir. Böbrek enfeksiyon sonrası TRM hücreleri de dahil olmak üzere birçok bağışıklık hücreleri barındırır ve olmayan bir mukozal dokuda TRM hücre biyolojisi çalışma için büyük bir fırsat sunuyor. İntraperitoneal yol ile akut LCMV (lenfositik koryomeningit virüsü) enfeksiyonu farelerde antijene özgü T hücre yanıtlarını incelemek için kurulmuş bir sistemik enfeksiyon modelidir. Enfeksiyon genellikle yabani tip farelerde 7-10 gün içinde çözülür ve böbrek10dahil olmak üzere çeşitli dokularda LCMV özgü bellek T hücrelerinin çok sayıda bırakın. P14 TCR (T hücre reseptörü) transgenik fareler CD8+ T hücreleri taşır, C57BL/6 farelerde MHC-I (sınıf I majör histokompatibilite kompleksi) molekülü H2-Db tarafından sunulan LCMV’nin immün dominant epitoplarından birini tanır. Farelerde konjenik olarak işaretlenmiş P14 T hücre evlat edinen transferi ve LCMV enfeksiyonu ile tom8+ efektör ve bellek T hücreleri, TRM farklılaşması ve homeostaz dahil olmak üzere izlenir.
Bağırsak intraepitelyal lenfositler (IEL) bölmesi ve tükürük bezleri gibi bazı bariyer dokularında, kurulan lenfosit izolasyon prosedürü fare LCMV modelinde en az kan kaynaklı T hücre kontaminasyonu ile TRM hücrelerinin yüksek yüzdesini verir11. Ancak, böbrek gibi bariyer olmayan dokularda, yoğun vasküler ağ dolaşımdaki CD8+ T hücrelerinin çok sayıda içerir. Başarılı perfüzyonun bile dolaşımdaki tüm CD8+ T hücrelerini verimli bir şekilde çıkaramadığı iyi belgelenmiştir. Bu teknik engeli aşmak için, intravasküler antikor boyama TRM laboratuvarlarında en sık kullanılan tekniklerden biri olarak kurulmuştur12. Kısaca, ötanaziden 3-5 dakika önce, 3 μg/mouse anti-CD8 antikor (CD8+ T hücrelerini etiketlemek için) intravenöz olarak teslim edilir. Sağlam kan damarı duvarı bu kısa sürede antikorların hızlı difüzyonunu önler (yani 3-5 dakika) ve sadece intravasküler hücreler etiketlenir. Standart lenfosit izolasyon protokolü takip, intravasküler karşı ekstravasküler hücreler kolayca akış sitometri kullanılarak ayırt edilebilir.
Burada, trm laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılan standart bir protokolü,13gün önce 30 gün önce CD45.1+ P14 T hücreleri ve LCMV enfeksiyonu aldı C57BL/6 fare kullanarak böbrek CD8+ T hücrelerinin lenfosit izolasyonve akış sitometri analizi gerçekleştirmek için açıklayacağız. Aynı protokol böbrekte hem efektör hem de bellek T hücrelerini incelemek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dokuya özgü bağışıklık araştırma hızlı genişleyen bir alan olduğu gibi, kanıt birikmesi bağışıklık hücreleri, özellikle lenfositler nüfus yetişkin insan veya enfekte veya aşılanmış farelerde hemen hemen tüm organlarda tespit edilebilir öneririz. LCMV fare enfeksiyonu modeli, antijene özgü T hücre yanıtı, efektör ve bellek T hücre farklılaşmasını incelemek için kurulmuş bir modeldir. Burada böbrekteki CD8+ T hücrelerini analiz etmek için bir protokol tanı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibe AI125701 ve AI139721, Kanser Araştırma Enstitüsü CLIP programı ve Amerikan Kanser Derneği hibe RSG-18-222-01-LIB n.z tarafından desteklenir. Flow Sitometri Tesisi’nden Karla Gorena ve Sebastian Montagnino’ya teşekkür ederiz. Flow Cytometry Paylaşılan Kaynak Tesisi’nde oluşturulan veriler San Antonio’daki Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi (UTHSCSA), NIH/NCI hibe P30 CA054174-20 (UTHSCSA’daki Klinik ve Çeviriaraştırma Merkezi [CTRC] ve UL1 TR001120 (Klinik ve ÇeviriBilim Ödülü) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
References
- Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
- Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence. Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).
- Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).
- Schenkel, J. M., et al. T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346, 98-101 (2014).
- Thome, J. J., Farber, D. L. Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans. Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).
- Mackay, L. K., et al. Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes. Science. 352, 459-463 (2016).
- Mackay, L. K., et al. T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate. Immunity. 43, 1101-1111 (2015).
- Milner, J. J., et al. Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours. Nature. 552, 253-257 (2017).
- Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells. Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance. Cell. 161, 737-749 (2015).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).
- Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation. Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477, 216-219 (2011).
- Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets. Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).
- Fernandez-Ruiz, D., et al. Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection. Immunity. 45, 889-902 (2016).
- Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532, 512-516 (2016).
