عزل الماوس الكلى المقيم CD8+ الخلايا T لتحليل تدفق cytometry
Summary
بعد العدوى الفيروسية, الكلى المرافئ عددا كبيرا نسبيا من CD8+ الخلايا T ويوفر فرصة لدراسة غير المخاطية Tالخلايا RM. هنا، نحن وصف بروتوكول لعزل الخلايا الليمفاوية الكلى الماوس لتحليل تدفق الخلايا.
Abstract
الأنسجة المقيمة الخلية T (TRM)هو حقل سريع التوسع من بحوث المناعة. عزل الخلايا التائية من الأنسجة غير اللمفاوية المختلفة هي واحدة من الخطوات الرئيسية للتحقيق TRMs. هناك اختلافات طفيفة في بروتوكولات عزل الخلايا الليمفاوية لمختلف الأعضاء. الكلى هو جهاز أساسي غير اللمفي مع العديد من اختراق الخلايا المناعية خاصة بعد التعرض لمسببات الأمراض أو تنشيط المناعة الذاتية. في السنوات الأخيرة، بدأت مختبرات متعددة بما في ذلك منطقتنا تميز الكلى مقيم CD8+ الخلايا التائية في مختلف الإعدادات الفسيولوجية والمرضية في كل من الماوس والإنسان. بسبب وفرة الخلايا الليمفاوية T، الكلى يمثل جهاز نموذج جذاب لدراسة TRMs في الأنسجة غير المخاطية أو غير الحاجز. هنا، سوف نصف بروتوكول يستخدم عادة في TRM-مختبرات تركز على عزل CD8+ الخلايا T من الكلى الماوس بعد العدوى الفيروسية الجهازية. باختصار، باستخدام فيروس التهاب الكورميات اللمفاوية الحاد (LCMV) نموذج العدوى في C57BL/6 الفئران، ونحن نبرهن على CD8 داخل الأوعيةالدموية + T الخلايا التسميات، والهضم الأنزيمية، وكثافة الانحدار الطرد المركزي لعزل وإثراء الخلايا الليمفاوية من الكلى الماوس لجعل العينات جاهزة لتحليل تدفق الخلايا اللاحقة.
Introduction
تمثل الخلايا التائية الخلايا النسيجية المقيمة (TRM)واحدة من أكثر الخلايا T في وفرة في الفئران البشرية المصابة والبالغة. TRM الخلايا توفير الخط الأول من الدفاع المناعي وتشارك بشكل حاسم في مختلف العمليات الفسيولوجية والمرضية1,2,3,4,5. مقارنة مع الخلايا T المتداولة، TRM الخلايا تحمل علامات سطح متميزة مع برامج النسخ فريدة من نوعها6،7،8. توسيع معرفتنا ببيولوجيا TRM هو المفتاح لفهم استجابات الخلايا التاتية التي تعتبر ضرورية لتطوير اللقاحات و العلاج المناعي في المستقبل.
بالإضافة إلى العلامات الجزيئية المشتركة المشتركة من TRMs عبر جميع الأنسجة غير اللمفاوية ، تشير الأدلة المتراكمة إلى أن السمات الخاصة بالأنسجة هي مكون مركزي من مادة البرمجة9. الكلى المرافئ العديد من الخلايا المناعية بما في ذلك خلاياجمهورية مقدونيا T بعد العدوى، ويوفر فرصة كبيرة لدراسة الخلايا TRM البيولوجيا في الأنسجة غير المخاطية. LCMV الحاد (التهاب الكورميات اللمفاوية فيروس) العدوى عن طريق الطريق intraperitoneal هو نموذج العدوى النظامية راسخة لدراسة استجابات الخلايا التائية المستضدية محددة في الفئران. وعادة ما يتم حل العدوى في 7-10 أيام في الفئران من النوع البري وترك عدد كبير من الخلايا T الذاكرة LCMV محددة في مجموعة متنوعة من الأنسجة، بما في ذلك الكلى10. P14 TCR (T cell receptor) الفئران المعدلة وراثيا تحمل CD8+ T الخلايا تعترف واحدة من epitopes المناعي المهيمنة من LCMV التي قدمها MHC-I (الفئة الأولى الرئيسية مجمع الهس القدرة على المنافسة) جزيء H2-Db في C57BL/6 الفئران. الجمع بين congenically P14 T نقل بالتبني الخلية وعدوى LCMV في الفئران، CD8+ effector والذاكرة الخلايا T يتم تتبعها، بما في ذلك TRM التمايز و homeostasis.
في بعض الأنسجة الحاجز، مثل الغدد الليمفاوية داخل الأمعاء (IEL) مقصورات الغدد اللعابية، أنشئت عملية عزل الخلايا الليمفاوية تسفر عن نسبة عالية من خلايا TRM مع الحد الأدنى من التلوث الخلايا T المنقولة بالدم في نموذج LCMV الماوس11. ومع ذلك، في الأنسجة غير الحاجز، مثل الكلى، شبكة الأوعية الدموية الكثيفة يحتوي على عدد كبير من الخلايا CD8+ T تعميم. وقد تم توثيقها جيدا أنه حتى perfusion ناجحة لا يمكن أن إزالة بكفاءة جميع تعميم CD8+ الخلايا T. للتغلب على هذه العقبة التقنية ، تم تأسيس تلطيخ الأجسام المضادة داخل الأوعية كواحد من التقنيات الأكثر استخدامًا في TRM مختبرات12. وباختصار، قبل 3-5 دقائق من القتل الرحيم، يتم تسليم 3 ميكروغرام/فأرة مضادة للأجسام المضادة CD8 (لتسمية CD8+ T cells) عن طريق الوريد. جدار الأوعية الدموية سليمة يمنع الانتشار السريع للجسم المضاد في غضون هذه الفترة القصيرة من الزمن (أي 3-5 دقائق) ويتم تسمية الخلايا داخل الأوعية فقط. بعد بروتوكول عزل الخلايا الليمفاوية القياسية، يمكن تمييز الخلايا داخل الأوعية مقابل الخلايا الإكستائية بسهولة باستخدام عملية استئصال الخلايا المتدفقة.
هنا، سوف نصف بروتوكول قياسي يستخدم عادة في مختبراتT RM لأداء وضع العلامات داخل الأوعية الدموية، والعزل اللمفاوي وتحليل تدفق الخلايا الخلوية CD8+ الخلايا التائية باستخدام C57BL/6 الماوس الذي تلقى CD45.1+ P14 الخلايا T و LCMV العدوى قبل 30 يوما13. ويمكن استخدام نفس البروتوكول لدراسة كل من الخلايا التي تؤثر على الجسم والذاكرة T في الكلى.
Protocol
Representative Results
Discussion
وبما أن مناعة الأنسجة المحددة هي مجال سريع التوسع في البحث، فإن تراكم الأدلة يشير إلى أن الخلايا المناعية، وخاصة الخلايا اللمفاوية يمكن تحديدها في جميع الأعضاء تقريبًا في الفئران البشرية أو المصابة أو المحصنة. LCMV نموذج عدوى الماوس هو نموذج راسخ لدراسة مستضدية محددة الخلية استجابة، والمف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح AI125701 وAI139721، وبرنامج معهد أبحاث السرطان كليب وجمعية السرطان الأمريكية منحة RSG-222-01-LIB إلى N.Z. نشكر كارلا جورينا وسيباستيان مونتانينو من مرفق تدفق الدراجات. تم دعم البيانات التي تم إنشاؤها في مرفق الموارد المشتركة للتدفق من قبل مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس في سان أنطونيو (UTHSCSA) ، ومنحة المعاهد القومية للصحة / NCI P30 CA054174-20 (مركز البحوث السريرية والترجمة [CTRC] في UTHSCSA) ، وUL1 TR001120 (جائزة العلوم السريرية والترجمة).
Materials
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
References
- Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
- Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence. Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).
- Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).
- Schenkel, J. M., et al. T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346, 98-101 (2014).
- Thome, J. J., Farber, D. L. Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans. Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).
- Mackay, L. K., et al. Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes. Science. 352, 459-463 (2016).
- Mackay, L. K., et al. T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate. Immunity. 43, 1101-1111 (2015).
- Milner, J. J., et al. Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours. Nature. 552, 253-257 (2017).
- Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells. Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance. Cell. 161, 737-749 (2015).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).
- Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation. Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477, 216-219 (2011).
- Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets. Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).
- Fernandez-Ruiz, D., et al. Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection. Immunity. 45, 889-902 (2016).
- Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532, 512-516 (2016).
