После вирусной инфекции, почки гавани относительно большое количество CD8И Т-клеток и предлагает возможность для изучения немукозальныхТ-РМ-клеток. Здесь мы описываем протокол изоляции лимфоцитов почек мыши для анализа цитометрии потока.
Ткань-резидент памяти Т-клеток (TRM) является быстро расширяющейся области иммунологических исследований. Изоляция Т-клеток от различных нелимфоидных тканей является одним из ключевых шагов для исследования TRMs. Существуют небольшие различия в протоколах изоляции лимфоцитов для различных органов. Почка является важным не лимфоидным органом с многочисленным проникновением иммунных клеток, особенно после воздействия патогена или аутоиммунной активации. В последние годы, несколько лабораторий, включая наши собственные начали характеризовать почек резидентовCD8 Т-клеток в различных физиологических и патологических условиях как у мыши и человека. Из-за обилия Т-лимфоцитов, почка представляет собой привлекательный орган модели для изучения TRMs в немукозыловых или небарьерных тканях. Здесь мы опишем протокол, обычно используемый в лабораториях, ориентированных на TRM,чтобы изолировать CD8и Т-клетки от почек мыши после системной вирусной инфекции. Кратко, используя острую лимфоцитарную модель инфекции вируса хориоменита (LCMV) у мышей C57BL/6, мы демонстрируем внутрисосудистыйCD8 и T-клеточную маркировку, энзиматическое пищеварение и градифугу плотности для изоляции и обогащения лимфоцитов из почек мыши, чтобы сделать образцы готовыми к последующему анализу цитометрии потока.
Ткань резидентов памяти (TRM) Т-клетки представляют собой один из наиболее распространенных Т-клеток населения у взрослых людей и инфицированных мышей. Т-РМ-клетки обеспечивают первую линию иммунной защиты и критически вовлечены в различные физиологические и патологическиепроцессы1,2,3,4,5. По сравнению с циркулирующими Т-клетками,Т-РМ клетки несут различные поверхностные маркеры суникальными программами транскрипции 6,7,8. Расширение наших знаний обиологии T RM является ключом к пониманию реакции Т-клеток, которая имеет важное значение для будущей разработки Т-клеточных вакцин и иммунотерапии.
В дополнение к широко разделяемым молекулярным маркерам TRMs во всех нелимфоидных тканях, накопление доказательств свидетельствует о том, что специфические особенности тканей являются центральным компонентомбиологии T RM9. Почки гавани многих иммунных клеток,включая Т-РМ клетки после инфекции и предлагает отличную возможность для изучения TRM клеточной биологии в немукосальной ткани. Острый LCMV (лимфоцитатический вирус хориомерингита) инфекции через внутриперитонеальный маршрут является устоявшейся системной модели инфекции для изучения антиген-специфических Т-клеток ответы у мышей. Инфекция обычно решается в 7-10 дней у диких мышей типа и оставить большое количество LCMV-специфических Т-клеток памяти в различных тканях, в том числепочки 10. P14 TCR (Т-клеточный рецептор) трансгенных мышей нести CD8И Т-клетки признают один из иммунных доминирующих эпитопов LCMV представлены MHC-I (класс I основной комплекс гистосовместимости) молекулы H2-Db в C57BL/6 мышей. Сочетание конгенически отмеченных P14 Т-клеток приемной передачи и LCMV инфекции у мышей,CD8 и эффектор памяти Т-клеток отслеживаются, в том числедифференциации T RM и гомеостаза.
В некоторых барьерных тканях, таких как кишечные интрапителеальные лимфоциты (IEL) отсека и слюнных желез, установленные лимфоциты изоляции процедура дает высокий процентТ-РМ клеток с минимальным загрязнением Т-клеток, переносимых кровью в мыши LCMVмодели 11. Тем не менее, в небарьерных тканях, таких как почки, плотная сосудистая сеть содержит большое количество циркулирующих CD8 и Т-клеток. Было хорошо задокументировано, что даже успешная перфузия не может эффективно удалить все циркулирующие CD8и Т-клетки. Чтобы преодолеть это техническое препятствие, внутрисосудистые антитела окрашивания была создана в качестве одного из наиболее часто используемых методов в TRM лаборатории 12. Короче говоря, за 3-5 минут до эвтаназии, 3 мкг / мышь анти-CD8 антитела (для обозначенияCD8 и Т-клеток) доставляется внутривенно. Нетронутая стенка кровеносных сосудов предотвращает быстрое распространение антител в течение этого короткого периода времени (т.е. 3-5 минут) и только внутрисосудистые клетки помечены. Следуя стандартному протоколу изоляции лимфоцитов, внутрисосудистые и экстрасосудистые клетки можно легко отличить с помощью цитометрии потока.
Здесь мы опишем стандартный протокол, обычно используемый влабораториях T RM для выполнения внутрисосудистой маркировки, лимфоцитоцитов изоляции и цитометрического анализа почек CD8и Т-клеток с помощью мыши C57BL/6, которая получила CD45.1 и P14 T-клеток и инфекции LCMV за 30дней до 13. Тот же протокол может быть использован для изучения как эффектор и Т-клетки памяти в почках.
Поскольку специфический иммунитет тканей является быстро расширяющейся областью исследований, накопление доказательств свидетельствует о том, что иммунные клетки, особенно популяция лимфоцитов, могут быть выявлены почти во всех органах у взрослых людей или инфицированных или иммун?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа поддерживается грантами NIH AI125701 и AI139721, Программой CLIP Института онкологических исследований и Американским онкологическим обществом гранта RSG-18-222-01-LIB в Н.З. Мы благодарим Карлу Горену и Себастьяна Монтаньино из Фонда Цитометрии Потока. Данные, полученные в потоке цитометрии Общие ресурсы фонда были поддержаны в Университете Техаса научный центр здравоохранения в Сан-Антонио (UTHSCSA), NIH / NCI грант P30 CA054174-20 (Клинические и трансляционные научно-исследовательский центр (CTRC) в UTHSCSA), и UL1 TR001120 (Клиническая и трансляционная научная премия).
1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
3 ml syringe | BD | 309657 | |
37C incubator | VWR | ||
Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
Insulin Syringe | BD | 329424 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
PBS | |||
Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
rocker | VWR | ||
RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |