Isolamento delle cellule CD8 + T residenti nei^reni del topo per l'analisi della citometria a flusso

Le cellule T di memoria residente nei tessuti (T_RM)rappresentano una delle popolazioni di cellule T più abbondanti nei topi adulti umani e infetti. Le cellule T_RM forniscono la prima linea di difesa immunitaria e sono coinvolte criticamente in vari processi fisiologici e^{patologici 1,2,3,4,5}. Confrontandosi con le cellule T circolanti, le celle T_RM trasportano marcatori di superficie distinti con programmi di trascrizione^{univoci 6,7,8}. Ampliare la nostra conoscenza della biologia T_RM è la chiave per comprendere le risposte delle cellule T, che è essenziale per il futuro sviluppo di vaccini e immunoterapie a base di cellule T.

Oltre ai marcatori molecolari comunemente condivisi di T_RMsu tutti i tessuti non linfoidi, l’accumulo di prove suggerisce che le caratteristiche specifiche dei tessuti sono una componente centrale della biologia T_RM ⁹. Il rene ospita molte cellule immunitarie tra cui le cellule T_RM dopo l’infezione e offre una grande opportunità per studiare la biologia cellulare T_RM in un tessuto non mucoso. L’infezione acuta da LCMV (virus della coriomeningite linfocitica) attraverso la via intraperitoneale è un modello di infezione sistemica ben consolidato per studiare le risposte delle cellule T specifiche dell’antigene nei topi. L’infezione viene solitamente risolta in 7-10 giorni in topi di tipo selvatico e lascia un gran numero di cellule T di memoria specifiche di LCMV in una varietà di tessuti, incluso il^{rene 10}. I topi transgenici P14 TCR (T cell receptor) trasportano cellule CD8⁺ T riconoscono uno degli epitopi immuno-dominanti dell’LCMV presentati dalla molecola H2-D b della molecola H2-D^b della classe I (complesso di istocompatibilità maggiore) nei topi C57BL/6. Viene monitorata la combinazione di trasferimento adottivo di cellule P14 T marcate congenicamente e infezione da LCMV nei topi, vengono monitorati l’effettore CD8⁺ e le cellule T di memoria, tra cui la differenziazione T_RM e l’omeostasi.

In alcuni tessuti barriera, come il compartimento dei linfociti intraepiteliali intestinali (IEL) e le ghiandole salivari, la procedura di isolamento dei linfociti stabilita produce_un’alta percentuale di cellule T RM con una contaminazione minima delle cellule T trasmessa dal sangue nel topo LCMV modello¹¹. Tuttavia, nei tessuti non barriera, come il rene, la fitta rete vascolare contiene un gran numero di cellule CD8⁺ T circolanti. È stato ben documentato che anche una perfusione riuscita non può rimuovere in modo efficiente tutte le cellule CD8⁺ T circolanti. Per superare questo ostacolo tecnico, la colorazione degli anticorpi intravascolari è stata stabilita come una delle tecniche più comunemente utilizzate nei laboratori T_RM ¹². In breve, 3-5 minuti prima dell’eutanasia, 3 μg/ anticorpo anti-CD8 del mouse (per etichettare le cellule CD8⁺ T) vengono consegnati per via endovenosa. La parete intatta dei vasi sanguigni impedisce una rapida diffusione dell’anticorpo in questo breve periodo di tempo (cioè 3-5 minuti) e vengono etichettate solo le cellule intravascolari. Seguendo il protocollo standard di isolamento dei linfociti, le cellule intravascolari rispetto a quelle extravascolari possono essere facilmente distinte usando la citometria a flusso.

Qui, descriveremo un protocollo standard comunemente utilizzato nei laboratori T_RM per eseguire l’etichettatura intravascolare, l’isolamento dei linfociti e l’analisi citometrica del flusso delle cellule REnali CD8⁺ T utilizzando un mouse C57BL/6 che ha ricevuto cellule CD45.1⁺ P14 T e infezione da LCMV 30 giorni prima^{delle 13}. Lo stesso protocollo può essere utilizzato per studiare sia le cellule T dell’effettore che della memoria nel rene.