Isolamento das células CD8⁺ T residentes em rim do rato para análise de citometria de fluxo

As células T de memória residente de tecido (T_RM) representam uma das populações de células T mais abundantes em camundongos humanos adultos e infectados. As células_{T RM} fornecem a primeira linha de defesa imunológica e estão criticamente envolvidas em diversos processos fisiológicos e patológicos^1,2,3,4,5. Comparando com as células T circulantes, as células T_RM carregam marcadores de superfície distintos com programas de transcrição únicos^6,7,8. Expandir nosso conhecimento sobre biologia T_RM é a chave para entender as respostas das células T, que é essencial para o desenvolvimento futuro de vacinas e imunoterapias baseadas em células T.

Além de marcadores moleculares comumente compartilhados de T_RMem todos os tecidos não linfoides, evidências acumuladas sugerem que características específicas do tecido são um componente central da biologia T_RM ⁹. O rim abriga muitas células imunes, incluindo células T_RM após a infecção e oferece uma grande oportunidade para estudar biologia celular T_RM em um tecido não mucosal. A infecção por LCMV (vírus da coiomeningite linfocítica) por via intraperitoneal é um modelo de infecção sistêmica bem estabelecido para estudar respostas de células T específicas de antígenos em camundongos. A infecção geralmente é resolvida em 7-10 dias em camundongos do tipo selvagem e deixa um grande número de células T de memória específica de LCMV em uma variedade de tecidos, incluindo o rim¹⁰. Camundongos transgênicos P14 TCR (receptor de células T) carregam células CD8⁺ T reconhecem um dos epítopos imunes dominantes do LCMV apresentados pela molécula MHC-I (complexo de histocompatibilidade maior classe I) H2-D^b em camundongos C57BL/6. Combinando transferência adotiva de células P14 T congênicamente marcadas e infecção por LCMV em camundongos, células T de efeito CD8⁺ e memória são rastreadas, incluindo diferenciação T_RM e homeostase.

Em alguns tecidos de barreira, como linfócitos intraepiteliais intestinais (IEL) compartimentos e glândulas salivares, o procedimento de isolamento de linfócitos estabelecido produz alta porcentagem de células T_RM com contaminação mínima das células T transmitidas pelo sangue no modelo¹¹LCMV do camundongo . No entanto, em tecidos não-barreiras, como o rim, a densa rede vascular contém um grande número de células CD8⁺ T circulantes. Foi bem documentado que mesmo a perfusão bem sucedida não pode remover eficientemente todas as células CD8⁺ T circulantes. Para superar esse obstáculo técnico, a coloração de anticorpos intravasculares foi estabelecida como uma das técnicas mais utilizadas nos laboratórios T_RM ¹². Em suma, 3-5 minutos antes da eutanásia, 3 μg /mouse anticorpo anti-CD8 (para rotular células CD8⁺ T) é entregue por via intravenosa. A parede intacta dos vasos sanguíneos previne a rápida difusão do anticorpo neste curto período de tempo (ou seja, 3-5 minutos) e apenas células intravasculares são rotuladas. Seguindo o protocolo padrão de isolamento do linfócito, as células intravasculares versus extravasculares podem ser facilmente distinguidas usando citometria de fluxo.

Aqui, descreveremos um protocolo padrão comumente utilizado em laboratórios T_RM para realizar rotulagem intravascular, isolamento de linfócitos e análise de citometria de fluxo de células rim CD8⁺ T usando um mouse C57BL/6 que recebeu células CD45.1⁺ P14 T e infecção por LCMV 30 dias antes^{do dia 13}. O mesmo protocolo pode ser usado para estudar células T e efeitos e memória no rim.