Isolering av Mus Njure-Resident CD8+ T-celler för Flow cytometri Analys
Summary
Efter virusinfektion, hamnar njure ett relativt stort antal CD8+ T-celler och erbjuder en möjlighet att studera icke-mucosal TRM celler. Här beskriver vi ett protokoll för att isolera mus njure lymfocyter för flöde cytometry analys.
Abstract
Tissue-resident minne T cell (TRM) är ett snabbt expanderande område för immunologi forskning. Isolera T-celler från olika icke-lymfoida vävnader är en av de viktigaste stegen för att undersöka TRMs. Det finns små variationer i lymfocytisoleringsprotokoll för olika organ. Njure är en väsentlig icke-lymfoida organ med många immun cell infiltration särskilt efter patogen exponering eller autoimmun aktivering. Under de senaste åren har flera laboratorier inklusive vår egen börjat karakterisera njure bosatt CD8+ T-celler i olika fysiologiska och patologiska inställningar i både mus och människa. På grund av överflödet av T-lymfocyter, utgör njure en attraktiv modell organ för att studera TRMs i icke-slemhinna eller icke-barriär vävnader. Här kommer vi att beskriva ett protokoll som vanligen används i TRM-fokuserade laboratorier för att isolera CD8+ T-celler från mus njurar efter systemisk virusinfektion. Kortfattat, med hjälp av en akut lymfatisk choriomeningitis virus (LCMV) infektion modell i C57BL/6 möss, vi visar intravaskulära CD8+ T cell märkning, enzymatisk matsmältning och densitet gradient centrifugation att isolera och berika lymfocyter från mus njurar att göra prover redo för den efterföljande flödet cytometri analys.
Introduction
Vävnad-resident minne (TRM) T-celler representerar en av de mest rikliga T-cell populationer i vuxna mänskliga och infekterade möss. TRM-celler ger den första raden av immun försvar och är kritiskt involverade i olika fysiologiska och patologiska processer1,2,3,4,5. Jämföra med cirkulerande T-celler, TRM celler bära distinkta ytmarkörer med unika transkription program6,7,8. Utöka vår kunskap om TRM biologi är nyckeln till att förstå T cell svar som är avgörande för framtida utveckling av T cell-baserade vacciner och immunterapier.
Förutom gemensamt delade molekylära markörer av TRMs över alla icke-lymfoida vävnader, ackumulerande bevis tyder på att vävnadsspecifika funktioner är en central komponent i TRM biologi9. Njure hamnar många immunceller inklusive TRM celler efter infektion och erbjuder en stor möjlighet att studera TRM cellbiologi i en icke-slemhinnan vävnad. Akut LCMV (lymfatisk choriomeningitis virus) infektion via intraperitoneal väg är en väletablerad systemisk infektion modell för att studera antigen-specifika T-cell svar hos möss. Infektionen är oftast löst i 7-10 dagar i vilda typ möss och lämna ett stort antal LCMV-specifika minne T-celler i en mängd olika vävnader, inklusivenjuren 10. P14 TCR (T-cell receptor) transgena möss bära CD8+ T-celler känner igen en av de immun-dominerande epitopes av LCMV presenteras av MHC-I (klass jag större histocompatibility komplex) molekyl H2-Db i C57BL/6 möss. Kombinera congenically märkt P14 T cell adoptivöverföring och LCMV infektion i möss, CD8+ effektor och minne T celler spåras, inklusive TRM differentiering och homeostas.
I vissa barriär vävnader, såsom intestinala intraepithelial lymfocyter (IEL) fack och spottkörtlar, etablerade lymfocyt isolering förfarande ger hög andel av TRM celler med minimal blodburna T-cells kontaminering i musen LCMV modell11. Men i icke-barriär vävnader, såsom njure, täta vaskulära nätverk innehåller ett stort antal cirkulerande CD8+ T-celler. Det har dokumenterats väl att även framgångsrik perfusion inte effektivt kan ta bort alla cirkulerande CD8+ T-celler. För att övervinna detta tekniska hinder har intravaskulär antikroppsfärgning fastställts som en av de vanligaste teknikerna i TRM labs12. I korthet, 3-5 minuter före dödshjälp, levereras 3 μg/mus anti-CD8-antikropp (för att märka CD8+ T-celler) intravenöst. Intakt blodkärlsvägg förhindrar snabb diffusion av antikroppen inom denna korta tidsperiod (dvs. 3-5 minuter) och endast intravaskulära celler är märkta. Efter standard lymfocyt isolering protokoll, intravaskulära kontra extravaskulära celler kan lätt särskiljas med hjälp av flödescytometri.
Här kommer vi att beskriva ett standardprotokoll som vanligen används i TRM labs att utföra intravaskulär märkning, lymfocytisolering och flödescytometri analys av njure CD8+ T-celler med hjälp av en C57BL/6 mus som har fått CD45.1+ P14 T-celler och LCMV infektion 30 dagar före13. Samma protokoll kan användas för att studera både effektor och minne T-celler i njuren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som vävnad specifik immunitet är ett snabbt expanderande område av forskning, ackumulerande bevis tyder på att immunceller, särskilt lymfocyter befolkningen kan identifieras i nästan alla organ i vuxna mänskliga eller infekterade eller immuniserade möss. LCMV mus infektion modell är en väletablerad modell för att studera antigen-specifika T-cell svar, effektor och minne T cell differentiering inklusive TRM biologi över flera vävnader. Här beskrev vi ett protokoll för att analysera CD8+</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NIH bidrag AI125701 och AI139721, Cancer Research Institute CLIP program och American Cancer Society bevilja RSG-18-222-01-LIB till N.Z. Vi tackar Karla Gorena och Sebastian Montagnino från Flow Cytometry Facility. Data som genereras i Flow Cytometry Shared Resource Facility stöddes av University of Texas Health Science Center i San Antonio (UTHSCSA), NIH/ NCI bevilja P30 CA054174-20 (Clinical and Translational Research Center [CTRC] vid UTHSCSA), och UL1 TR001120 (Clinical and Translational Science Award).
Materials
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
References
- Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
- Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence. Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).
- Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).
- Schenkel, J. M., et al. T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346, 98-101 (2014).
- Thome, J. J., Farber, D. L. Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans. Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).
- Mackay, L. K., et al. Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes. Science. 352, 459-463 (2016).
- Mackay, L. K., et al. T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate. Immunity. 43, 1101-1111 (2015).
- Milner, J. J., et al. Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours. Nature. 552, 253-257 (2017).
- Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells. Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance. Cell. 161, 737-749 (2015).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).
- Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation. Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477, 216-219 (2011).
- Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets. Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).
- Fernandez-Ruiz, D., et al. Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection. Immunity. 45, 889-902 (2016).
- Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532, 512-516 (2016).
