Изоляция мыши Почки-Резидент CD8 -^{Т-клетки} для анализа цитометрии потока

Ткань резидентов памяти (T_RM) Т-клетки представляют собой один из наиболее распространенных Т-клеток населения у взрослых людей и инфицированных мышей. Т-РМ-клетки обеспечивают первую линию иммунной защиты и критически вовлечены в различные физиологические и патологические^{процессы1,}2,^3,4,5. По сравнению с циркулирующими Т-клетками,_Т-РМ клетки несут различные поверхностные маркеры с^{уникальными программами транскрипции 6,7,8.} Расширение наших знаний о_{биологии} T RM является ключом к пониманию реакции Т-клеток, которая имеет важное значение для будущей разработки Т-клеточных вакцин и иммунотерапии.

В дополнение к широко разделяемым молекулярным маркерам T_RMs во всех нелимфоидных тканях, накопление доказательств свидетельствует о том, что специфические особенности тканей являются центральным компонентом_{биологии} T RM^9. Почки гавани многих иммунных клеток,_{включая Т-РМ} клетки после инфекции и предлагает отличную возможность для изучения T_RM клеточной биологии в немукосальной ткани. Острый LCMV (лимфоцитатический вирус хориомерингита) инфекции через внутриперитонеальный маршрут является устоявшейся системной модели инфекции для изучения антиген-специфических Т-клеток ответы у мышей. Инфекция обычно решается в 7-10 дней у диких мышей типа и оставить большое количество LCMV-специфических Т-клеток памяти в различных тканях, в том числе^{почки 10}. P14 TCR (Т-клеточный рецептор) трансгенных мышей нести CD8^И Т-клетки признают один из иммунных доминирующих эпитопов LCMV представлены MHC-I (класс I основной комплекс гистосовместимости) молекулы H2-D^b в C57BL/6 мышей. Сочетание конгенически отмеченных P14 Т-клеток приемной передачи и LCMV инфекции у мышей,^CD8 и эффектор памяти Т-клеток отслеживаются, в том числе_{дифференциации} T RM и гомеостаза.

В некоторых барьерных тканях, таких как кишечные интрапителеальные лимфоциты (IEL) отсека и слюнных желез, установленные лимфоциты изоляции процедура дает высокий процент_{Т-РМ клеток} с минимальным загрязнением Т-клеток, переносимых кровью в мыши LCMV^{модели 11}. Тем не менее, в небарьерных тканях, таких как почки, плотная сосудистая сеть содержит большое количество циркулирующих CD8 и Т-клеток. Было хорошо задокументировано, что даже успешная перфузия не может эффективно удалить все циркулирующие CD8^{и Т-клетки.} Чтобы преодолеть это техническое препятствие, внутрисосудистые антитела окрашивания была создана в качестве одного из наиболее часто используемых методов в T_RM ^{лаборатории 12}. Короче говоря, за 3-5 минут до эвтаназии, 3 мкг / мышь анти-CD8 антитела (для обозначения^CD8 и Т-клеток) доставляется внутривенно. Нетронутая стенка кровеносных сосудов предотвращает быстрое распространение антител в течение этого короткого периода времени (т.е. 3-5 минут) и только внутрисосудистые клетки помечены. Следуя стандартному протоколу изоляции лимфоцитов, внутрисосудистые и экстрасосудистые клетки можно легко отличить с помощью цитометрии потока.

Здесь мы опишем стандартный протокол, обычно используемый в_{лабораториях} T RM для выполнения внутрисосудистой маркировки, лимфоцитоцитов изоляции и цитометрического анализа почек CD8^и Т-клеток с помощью мыши C57BL/6, которая получила CD45.1 и P14 T-клеток и инфекции LCMV за 30^{дней до 13}. Тот же протокол может быть использован для изучения как эффектор и Т-клетки памяти в почках.