Summary

Isolamento das células CD8+ T residentes em rim do rato para análise de citometria de fluxo

Published: June 27, 2020
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Summary

Após a infecção viral, o rim abriga um número relativamente grande de células CD8+ T e oferece uma oportunidade de estudar células TRM não mucosas. Aqui, descrevemos um protocolo para isolar linfócitos renais de camundongos para análise de citometria de fluxo.

Abstract

A célula T dememória residente em tecido é um campo de pesquisa de imunologia em rápida expansão. Isolar células T de vários tecidos não linfoides é um dos passos fundamentais para investigar TRMs. Há pequenas variações nos protocolos de isolamento de linfócitos para diferentes órgãos. O rim é um órgão não linfoide essencial com numerosa infiltração de células imunes especialmente após a exposição ao patógeno ou ativação autoimune. Nos últimos anos, vários laboratórios, incluindo o nosso, começaram a caracterizar células CD8+ T residentes nos rins em vários ambientes fisiológicos e patológicos tanto em camundongos quanto em humanos. Devido à abundância de linfócitos T, o rim representa um órgão modelo atraente para estudar TRMsem tecidos não mucosas ou não-barreiras. Aqui, descreveremos um protocolo comumente usado em laboratórios focados em TRMpara isolar células CD8+ T de rins de camundongos após infecção viral sistêmica. Brevemente, utilizando um modelo de infecção por coriomeningite linfocítica aguda (LCMV) em camundongos C57BL/6, demonstramos rotulagem intravascular de células CD8+ T, digestão enzimática e centrífuga de gradiente de densidade para isolar e enriquecer linfócitos de rins de camundongos para preparar amostras para a análise de citometria de fluxo subsequente.

Introduction

As células T de memória residente de tecido (TRM) representam uma das populações de células T mais abundantes em camundongos humanos adultos e infectados. As célulasT RM fornecem a primeira linha de defesa imunológica e estão criticamente envolvidas em diversos processos fisiológicos e patológicos1,2,3,4,5. Comparando com as células T circulantes, as células TRM carregam marcadores de superfície distintos com programas de transcrição únicos6,7,8. Expandir nosso conhecimento sobre biologia TRM é a chave para entender as respostas das células T, que é essencial para o desenvolvimento futuro de vacinas e imunoterapias baseadas em células T.

Além de marcadores moleculares comumente compartilhados de TRMem todos os tecidos não linfoides, evidências acumuladas sugerem que características específicas do tecido são um componente central da biologia TRM 9. O rim abriga muitas células imunes, incluindo células TRM após a infecção e oferece uma grande oportunidade para estudar biologia celular TRM em um tecido não mucosal. A infecção por LCMV (vírus da coiomeningite linfocítica) por via intraperitoneal é um modelo de infecção sistêmica bem estabelecido para estudar respostas de células T específicas de antígenos em camundongos. A infecção geralmente é resolvida em 7-10 dias em camundongos do tipo selvagem e deixa um grande número de células T de memória específica de LCMV em uma variedade de tecidos, incluindo o rim10. Camundongos transgênicos P14 TCR (receptor de células T) carregam células CD8+ T reconhecem um dos epítopos imunes dominantes do LCMV apresentados pela molécula MHC-I (complexo de histocompatibilidade maior classe I) H2-Db em camundongos C57BL/6. Combinando transferência adotiva de células P14 T congênicamente marcadas e infecção por LCMV em camundongos, células T de efeito CD8+ e memória são rastreadas, incluindo diferenciação TRM e homeostase.

Em alguns tecidos de barreira, como linfócitos intraepiteliais intestinais (IEL) compartimentos e glândulas salivares, o procedimento de isolamento de linfócitos estabelecido produz alta porcentagem de células TRM com contaminação mínima das células T transmitidas pelo sangue no modelo11LCMV do camundongo . No entanto, em tecidos não-barreiras, como o rim, a densa rede vascular contém um grande número de células CD8+ T circulantes. Foi bem documentado que mesmo a perfusão bem sucedida não pode remover eficientemente todas as células CD8+ T circulantes. Para superar esse obstáculo técnico, a coloração de anticorpos intravasculares foi estabelecida como uma das técnicas mais utilizadas nos laboratórios TRM 12. Em suma, 3-5 minutos antes da eutanásia, 3 μg /mouse anticorpo anti-CD8 (para rotular células CD8+ T) é entregue por via intravenosa. A parede intacta dos vasos sanguíneos previne a rápida difusão do anticorpo neste curto período de tempo (ou seja, 3-5 minutos) e apenas células intravasculares são rotuladas. Seguindo o protocolo padrão de isolamento do linfócito, as células intravasculares versus extravasculares podem ser facilmente distinguidas usando citometria de fluxo.

Aqui, descreveremos um protocolo padrão comumente utilizado em laboratórios TRM para realizar rotulagem intravascular, isolamento de linfócitos e análise de citometria de fluxo de células rim CD8+ T usando um mouse C57BL/6 que recebeu células CD45.1+ P14 T e infecção por LCMV 30 dias antesdo dia 13. O mesmo protocolo pode ser usado para estudar células T e efeitos e memória no rim.

Protocol

Todos os experimentos em animais realizados após este protocolo devem ser aprovados pelo respectivo Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). Todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pela IACUC UT Health San Antonio. 1. Transferência adotiva de células P14 T para receptores C57BL/6 e infecção por LCMV Use ratos P14 com 6-12 semanas de idade. Certifique-se de que o sexo do doador P14 TCR transgênico do mouse deve coincidir com o sexo de camundongos…

Representative Results

O protocolo descrito aqui é resumido em um fluxograma(Figura 1A). No dia 30 pós infecção por LCMV, realizamos rotulagem intravascular de células CD8+ T. 5 minutos depois, ambos os rins do animal foram dissecados, picados e submetidos à digestão da colagemnase. Os linfócitos foram purificados ainda mais das amostras digeridas via centrífuga percoll e analisados por citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 1B, mesmo após o enriquecimento d…

Discussion

Como a imunidade específica do tecido é uma área de pesquisa em rápida expansão, evidências acumuladas sugerem que as células imunes, especialmente a população de linfócitos, podem ser identificadas em quase todos os órgãos em camundongos adultos humanos ou infectados ou imunizados. O modelo de infecção por camundongos LCMV é um modelo bem estabelecido para estudar a resposta celular T específica do antígeno, a diferenciação de células T e a diferenciação de células T, incluindo a biologia TRM…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é apoiado pelas bolsas NIH AI125701 e AI139721, o programa CLIP do Cancer Research Institute e a American Cancer Society concedem RSG-18-222-01-LIB à N.Z. Agradecemos a Karla Gorena e Sebastian Montagnino da Instalação de Citometria de Fluxo. Os dados gerados no Flow Cytometry Shared Resource Facility foram apoiados pelo Centro de Ciência da Saúde da Universidade do Texas em San Antonio (UTHSCSA), NIH/NCI grant P30 CA054174-20 (Clinical and Translational Research Center (CTRC) na UTHSCSA) e UL1 TR001120 (Clinical and Translational Science Award).

Materials

1.5 ml microcentrifuge tubes Fisherbrand 05-408-130
15 ml Conical Tubes Corning 431470
3 ml syringe BD 309657
37C incubator VWR
Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) Tonbo Biosciences 30-0081-U025
Calf Serum GE Healthcare Life Sciences SH30073.03
Collegenase B Millipore Sigma 11088807001
Disposable Graduated Transfer Pipettes Fisherbrand 13-711-9AM
Insulin Syringe BD 329424
Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical RS 5692
Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit Biolegend 480043
overhead heat lamp Amazon B00333PZZG
PBS
Percoll GE Healthcare Life Sciences 17089101
rocker VWR
RPMI GE Healthcare Life Sciences SH30096.01
Solid Brass Mouse Restrainer Braintree Scientific, Inc SAI-MBR
Swing Bucket Centrifuge with refrigerator Thermofisher
Tissue Culture 6-well plate Corning 3516

References

  1. Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
  2. Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence. Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).
  3. Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).
  4. Schenkel, J. M., et al. T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346, 98-101 (2014).
  5. Thome, J. J., Farber, D. L. Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans. Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).
  6. Mackay, L. K., et al. Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes. Science. 352, 459-463 (2016).
  7. Mackay, L. K., et al. T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate. Immunity. 43, 1101-1111 (2015).
  8. Milner, J. J., et al. Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours. Nature. 552, 253-257 (2017).
  9. Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells. Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).
  10. Steinert, E. M., et al. Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance. Cell. 161, 737-749 (2015).
  11. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
  12. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).
  13. Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation. Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).
  14. Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477, 216-219 (2011).
  15. Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets. Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).
  16. Fernandez-Ruiz, D., et al. Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection. Immunity. 45, 889-902 (2016).
  17. Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532, 512-516 (2016).

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Cite This Article
Liao, W., Ma, C., Zhang, N. Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis. J. Vis. Exp. (160), e61559, doi:10.3791/61559 (2020).

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