Summary

유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8+ T 세포의 격리

Published: June 27, 2020
doi:

Summary

바이러스 감염에 이어 신장은 비교적 많은 수의 CD8+ T 세포를 수용하고 비 점막 TRM 세포를 연구할 기회를 제공합니다. 여기서는 유동 세포측정 분석을 위해 마우스 신장 림프구를 분리하는 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

조직-주민 기억 T 세포 (TRM)는면역학 연구의 급속하게 확장 분야입니다. 다양한 비 림프구 조직에서 T 세포를 격리하는 것은 TRMs를 조사하는 주요 단계 중 하나입니다. 다른 장기에 대한 림프구 절연 프로토콜에는 약간의 변화가 있습니다. 신장은 병원체 노출 또는 자가 면역 활성화 후에 특히 수많은 면역 세포 침투를 가진 필수적인 비 림프구 기관입니다. 최근 몇 년 동안, 우리 자신의 여러 실험실은 마우스와 인간 모두에서 다양한 생리 및 병리학 적 설정에서 신장 거주자 CD8+ T 세포를 특성화하기 시작했다. T 림프구의 풍부로 인해 신장은 비 점막 또는 비 장벽 조직에서 TRMs를 연구하는 매력적인 모델 기관을 나타냅니다. 여기에서, 우리는 전신 바이러스성 감염 다음 마우스 신장에서 CD8+ T 세포를 격리하기 위하여 TRM집중한 실험실에서 일반적으로 이용되는 프로토콜을 설명할 것입니다. 간략하게, C57BL/6 마우스에서 급성 림프구성 초리오메닌염 바이러스(LCMV) 감염 모델을 사용하여, 마우스 신장에서 림프구를 분리하고 농축하기 위해 마우스 신장에서 림프구를 분리하고 농축하는 진래성 CD8+ T 세포 라벨링, 밀도 그라데이션 원심을 시연하여 후속 사이클분석을 위한 시료를 준비하고 있다.

Introduction

조직-상주 기억(TRM)T 세포는 성인 인간 및 감염된 마우스에서 가장 풍부한 T 세포 집단 중 하나를 나타낸다. TRM 세포는 면역 방어의 첫 번째 라인을 제공하고 다양한 생리학적 및 병리학과정에 비판적으로관여1,2,3,4,5. 순환 T 세포와 비교하여 TRM 세포는 고유한 전사 프로그램6,7,8을가진 뚜렷한 표면마커를운반한다. TRM 생물학에 대한 지식을 확장하는 것은 T 세포 기반 백신 및 면역 요법의 미래 발달에 필수적인 T 세포 반응을 이해하는 열쇠입니다.

모든 비 림프구 조직에 걸쳐 TRMs의일반적으로 공유 분자 마커 이외에, 축적 증거는 조직 특정 특징이 TRM 생물학9의중앙 구성 요소임을 시사한다. 신장은 감염 후에 TRM 세포를 포함하여 많은 면역 세포를 항구하고 비 점막 조직에서 TRM 세포 생물학을 공부하는 좋은 기회를 제공합니다. 급성 LCMV(림프구성 초뇌염 바이러스) 감염은 관면 경로를 통한 잘 확립된 조직 감염 모델로 마우스에서 항원 특이적 T 세포 반응을 연구한다. 감염은 일반적으로 야생 형 마우스에서 7-10 일 이내에 해결되고 신장10을포함한 다양한 조직에서 많은 수의 LCMV 특이적 메모리 T 세포를 남깁니다. P14 TCR(T 세포 수용체) 형질전환 마우스는 C57BL/6 마우스에서 MHC-I(클래스 I 주요 조직적합성 복합체) 분자 H2-Db에 의해 제시된 LCMV의 면역 지배적 인 에피토프 중 하나를 인식CD8+ T 세포를 운반한다. 쥐에서 친자적으로 표시된 P14 T 세포 입양 전달 및 LCMV 감염을 결합하면 CD8+ 이펙터 및 메모리 T 세포가 TRM 분화 및 항상성을 포함하여 추적됩니다.

장 내 상피 림프구(IEL) 구획 및 침샘과 같은 일부 장벽 조직에서는, 확립된 림프구 절연 절차는 마우스 LCMV모델(11)에서혈액 매개 T 세포 오염을 최소화한 TRM 세포의 높은 비율을 산출한다. 그러나 신장과 같은 비장벽 조직에서 조밀한 혈관 망에는 많은 수의 순환 CD8+ T 세포가 포함되어 있습니다. 성공적인 관류조차도 모든 순환 CD8+ T 세포를 효율적으로 제거할 수 없다는 것이 잘 문서화되어 있습니다. 이러한 기술적 장애물을 극복하기 위해, 내트라바스 항체 염색은 TRM 실험실(12)에서가장 일반적으로 사용되는 기술 중 하나로 확립되었다. 잠시, 안락사 전에 3-5 분, 3 μg /마우스 안티 CD8 항체 (CD8+ T 세포를 레이블) 정맥으로 전달된다. 그대로 혈관 벽은 시간의 이 짧은 기간 (즉, 3-5 분) 안에 항체의 급속한 확산을 방지하고 단지 내트라바스 내 세포가 표지됩니다. 표준 림프구 절연 프로토콜에 따라, 비대 혈관 세포대 는 유동 세포 세포를 사용하여 쉽게 구별될 수 있다.

여기서, 우리는13일전에 CD45.1+ P14 T 세포 및 LCMV 감염을 받은 C57BL/6 마우스를 사용하여 신장 CD8+ T 세포의 신장CD8+ T 세포의 내트라바스 내 라벨링, 림프구 절연 및 유동 세포 측정 분석을 수행하기 위해 TRM 실험실에서 일반적으로 사용되는 표준 프로토콜을 설명할 것이다. 동일한 프로토콜은 신장에 있는 이펙터 및 메모리 T 세포를 둘 다 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.

Protocol

이 프로토콜에 따라 수행된 모든 동물 실험은 각 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받아야 합니다. 여기에 설명 된 모든 절차는 IACUC UT 건강 샌 안토니오에 의해 승인되었습니다. 1. P14 T 세포의 채택 전달 C57BL/6 받는 사람 및 LCMV 감염 6-12 주에 P14 마우스를 사용 하십시오. 기증자 P14 TCR 형질전환 마우스의 성별이 C57BL/6 받는 쥐의 성별과 일치해야 하는지 확인…

Representative Results

여기에 설명된 프로토콜은 플로우차트(그림 1A)로요약되어 있습니다. 30 일째LCMV 감염, 우리는 CD8+ T 세포의 내트라바스큘러 라벨링을 수행했습니다. 5분 후, 동물의 두 신장은 해부되고, 다진 후 콜라게나아제 소화를 당했습니다. 림프구는 Percoll 원심분리를 통해 소화된 시료로부터 더 정제되었고 유동 세포측정에 의해 분석되었다. 도 1B에도시?…

Discussion

조직 특정 면역은 연구의 급속한 확장 영역으로, 축적 증거는 면역 세포, 특히 림프구 인구성인 인간 또는 감염 또는 예방 접종 마우스에 거의 모든 기관에서 식별 될 수 있음을 시사한다. LCMV 마우스 감염 모델은 여러 조직에 걸쳐 TRM 생물학을 포함하는 항원 특이적 T 세포 반응, 이펙터 및 메모리 T 세포 분화를 연구하는 잘 확립된 모델이다. 여기서, 우리는 신장에 있는 CD8+ T 세포?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 NIH 보조금 AI125701 및 AI139721, 암 연구소 클립 프로그램 및 미국 암 학회는 N.Z에 RSG-18-222-01-LIB를 부여하여 지원됩니다. 플로우 세포측정 시설에서 카를라 고레나와 세바스찬 몬타그니노에게 감사드립니다. 플로우 세포측정 공유 자원 시설에서 생성된 데이터는 샌안토니오 텍사스 대학교 건강 과학 센터(UTHSCSA), NIH/NCI 보조금 P30 CA054174-20(UTHSCSA의 임상 및 번역 연구 센터 [CTRC] 및 UL1 TR001120(임상 및 번역 과학 상)에 의해 지원되었습니다.

Materials

1.5 ml microcentrifuge tubes Fisherbrand 05-408-130
15 ml Conical Tubes Corning 431470
3 ml syringe BD 309657
37C incubator VWR
Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) Tonbo Biosciences 30-0081-U025
Calf Serum GE Healthcare Life Sciences SH30073.03
Collegenase B Millipore Sigma 11088807001
Disposable Graduated Transfer Pipettes Fisherbrand 13-711-9AM
Insulin Syringe BD 329424
Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical RS 5692
Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit Biolegend 480043
overhead heat lamp Amazon B00333PZZG
PBS
Percoll GE Healthcare Life Sciences 17089101
rocker VWR
RPMI GE Healthcare Life Sciences SH30096.01
Solid Brass Mouse Restrainer Braintree Scientific, Inc SAI-MBR
Swing Bucket Centrifuge with refrigerator Thermofisher
Tissue Culture 6-well plate Corning 3516

References

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Cite This Article
Liao, W., Ma, C., Zhang, N. Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis. J. Vis. Exp. (160), e61559, doi:10.3791/61559 (2020).

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